1、荧光色染发操作方法
免疫荧光染色的主要原理是利用抗原抗体之间的特异性结合来显示目的蛋白，主要包括蛋白和一抗结合，其次是带有荧光基团的二抗识别并结合一抗，荧光显微镜下即可观察到荧光，下文主要列举了三种细胞免疫荧光染色的实验步骤。
一、zo-1的免疫荧光，步骤如下：
1. 细胞在盖片上生长融合到95%-100%时，从孵箱中取出。
2. 用预温的1×PBS洗3次，每次10分钟。
3. 4%的甲醛室温固定20-30分钟。
4. 1×PBS洗3次，每次10分钟。
5. 0.2%Triton X-100透化2-5分钟。
6. 1×PBS洗3次，每次10分钟。
7. 5%BSA室温封闭30分钟。
8. 加一抗（用1%BSA稀释）放在湿盒里，4度过夜。
9. 1×PBS洗3次，每次10分钟。
10. 加二抗(用1%BSA稀释)30分钟，闭光。
11. 1×PBS洗3次，每次10分钟。
12. 95%甘油封片。
注：4%甲醛，0.2%Triton，5%BSA均用1×PBS稀释。
二、细胞爬片的免疫荧光步骤基本一致：
1. 取出细胞爬片放到35mm或60mm用过的细胞培养皿里，PBS洗三遍。注意：有的时候作的细胞爬片可能比较小，因此夹取的时候要小心，注意 反正面，放在皿里洗比较方便，避免了来回夹取，另外洗的时候加PBS不要太冲，不要细胞冲下来。洗的时候我都是多加PBS，稍晃一下就倒掉，没有等5分钟或10分钟。
2. 4%冷的多聚甲醛固定20分钟，PBS洗三遍。
3. 0.2%Triton X-100通透10分钟，PBS洗三遍。
4. 与二抗相同宿主的血清封闭30分钟，PBS洗三遍。
5. 一抗4度湿盒内过夜，也可37度2小时，感觉前者效果好，PBS洗三遍。
6. 二抗室温2小时(避光)，或者37度1半小时，PBS洗三遍。
7. 最好用DAPI染核，然后直接照荧光片。
8. 蒸馏水洗掉PBS，甘油封片，指甲油封片子的四周，因为甘油不象树脂那样会干，所以不用指甲油封的话会弄的一塌糊涂。
建议：
1. 还是染完之后没有封片前直接照一些，因为有的时候可能封片会出现问题，再想照反而没有了，另外不要拖太长时间，荧光会崔灭的。
2. 荧光的片子一定要避光保存，保存的好的话，过一段时间仍然能照出很好的片子。
3. 二抗用之前一定离心，不然有的时候有那种沉淀，在片子上就是一个很大的非特异性荧光光点，非常难看。
三、细胞免疫荧光简单实验步骤如下：
1.漂洗血清蛋白H7、2-7、4 37度 PBS 2小时。
2. -20度甲醇固定20分钟后,自然、干燥 10分钟。
3. PBS洗净：3min×3。
4. 1%Triton：25 min~30 min、配成50 ultriton+5 mlpBS。
5. PBS洗净：2×5 min。
6. 羊血清封闭：37度，20分钟。
7. 一抗，4度过夜，一般要大于18小时或者37度，1-2小时。
8. 4度PBS洗净，3 min×5次。
9. 二抗37度小于一小时。
10. 37度 PBS洗净，3×5 min。
11. 凉干封片（封闭液PH8.5）
不管采用何种方法，在使用PBS缓冲液漂洗时，都要漂洗干净并且要测下pH值，可以使用PBS多清洗几次，也可以延长PBS清洗时间，如果结果背景较高可以延长漂洗的次数和时间。
2、求免疫组化冰冻切片荧光染色具体流程
wifgw
石蜡切片免疫组化染色步骤
石蜡切片免疫组化染色步骤
1、载玻片的处理： 抗原修复过程中，由于高温、高压、辐射等诸多因素的影响，极易造成脱片。为保证试验的正常进行，可选用我公司提供的ZLI-9001 APES、ZLI-9003 HistogripTM或ZLI-9005 Poly-L-Lysine等几种试剂，对已清洗的载玻片进行处理。具体方法如下：
1.1 APES：现用现配。将洗净的玻片放入以1:50比例丙酮稀释的APES中，停留20~30秒钟，取出稍停片刻，再入纯丙酮溶液或蒸馏水中涮去未结合的APES，置通风橱中晾干即可。用此载玻片捞片时应注意组织要一步到位，并尽量减少气泡的存在，以免影响染色结果。
1.2 HistogripTM：将洗净的玻片放入以1:50比例丙酮稀释的Histogrip液中，停留1~2分钟，然后用双蒸水快速清洗三次，室温干燥或60oC烤箱烘烤一小时，装盒备用。
1.3 Poly-L-Lysine：将洗净、干燥的载玻片放入以1:10比例去离子水稀释的多聚赖氨酸溶液中，浸泡5分钟，60oC烤箱烘烤一小时或室温过夜干燥。装盒备用。试验中使用的器具均为非玻璃制品。 2、常用酶消化： 2.1 胰蛋白酶：一般使用浓度为0.05%~0.1%，消化时间为37℃、10~40分钟，主要用于细胞内抗原的显示。
2.2 胃蛋白酶：一般使用浓度为0.4%，消化时间为37℃、30~180分钟，主要用于细胞间质抗原的显示，如：Laminin（层粘蛋白），Collagen IV（IV型胶原）等。
g/ml的saponin溶液，消化时间为室温孵育30分钟。 2.3 皂素（Saponin）：一般使用浓度为2~10 3、抗原热修复： 可根据实验室的具体条件，选用微波炉抗原修复、高压锅抗原修复或水浴高温抗原修复。抗原热修复可选用各种缓冲液，如TBS、PBS、重金属盐溶液等，但实验证明，以0.01M枸橼酸盐缓冲液（pH6.0）效果最好。请选用我公司提供的ZLI-9064 枸橼酸盐缓冲液（粉剂）配制，取该粉剂一包溶于1000ml的蒸馏水中，混匀，其pH值在6.0 0.1，如因蒸馏水本身造成的pH值偏差，请自行调整。
3.1 石蜡切片微波炉抗原修复操作方法：切片脱蜡至水后，3％H2O2处理10分钟，蒸馏水洗2分钟×3。将切片放入盛有枸橼酸盐缓冲液（工作液）的容器中，置微波炉内加热使容器内液体温度保持在92℃~98℃之间并持续10~15分钟（注意：无论是使用医用或家用微波炉，请根据具体机型酌情设置条件，务必满足以上步骤中对温度和时间的要求）。取出容器，室温冷却10~20分钟（注意：不可将切片从缓冲液中取出冷却，以便使蛋白能够恢复原有的空间构型）。PBS洗，下接免疫组化染色步骤。
3.2 石蜡切片高压抗原修复操作方法：切片脱蜡至水。将1500ml~3000ml的枸橼酸盐缓冲液（工作液）注入不锈钢压力锅中加热至沸腾。切片置于金属架上，放入锅内，使切片位于液面以下，盖锅压阀。当压力锅开始慢慢喷气时（约加热5~6分钟后），计时1~2分钟，然后将压力锅端离热源，冷水冲至室温后，取下气阀，打开锅盖，取出切片，蒸馏水洗后，PBS洗2分钟×3，下接免疫组化染色步骤。
3.3 石蜡切片电炉煮沸抗原修复操作方法：切片脱蜡至水后，放入盛有枸橼酸盐缓冲液（工作液）的容器中，并将此容器置于盛有一定数量自来水的大器皿中，电炉上加热煮沸，从小容器的温度到达92℃~98℃起开始计时15~20分钟，然后端离电炉，室温冷却20~30分钟，蒸馏水冲洗，PBS洗，下接免疫组化染色步骤。 4、免疫组化染色步骤： （以美国ZYMED公司SP试剂盒为例）
石蜡切片脱蜡至水。
3%H2O2室温孵育5~10分钟，以消除内源性过氧化物酶的活性。
蒸馏水冲洗，PBS浸泡5分钟，(如需采用抗原修复，可在此步后进行)。
5~10％正常山羊血清（PBS稀释）封闭，室温孵育10分钟。倾去血清，勿洗，滴加适当比例稀释的一抗或一抗工作液，37℃孵育1~2小时或4℃过夜。
PBS冲洗，5分钟×3次。
滴加适当比例稀释的生物素标记二抗（1%BSA-PBS稀释），37℃孵育10~30分钟；或滴加第二代生物素标记二抗工作液，37℃或室温孵育10~30分钟。
PBS冲洗，5分钟×3次。
滴加适当比例稀释的辣根酶标记链霉卵白素（PBS稀释），37℃孵育10~30分钟；或第二代辣根酶标记链霉卵白素工作液，37℃或室温孵育10~30分钟。
PBS冲洗，5分钟×3次。
显色剂显色（DAB或AEC）。
自来水充分冲洗，复染，封片。
冰冻切片免疫组化染色步骤
m，室温放置30分钟后，入4℃丙酮固定10分钟，PBS洗，5分钟×3。用3％过氧化氢孵育5~10分钟，消除内源性过氧化物酶的活性。PBS洗，5分钟×2。冰冻切片4~8
免疫组化非特异性染色的消除方法
一、非特异性染色的主要因素
组织的非特异性染色的机理很复杂，其产生的原因主要可分为以下几点：
（1）一部分荧光素未与蛋白质结合，形成了聚合物和衍化物，而不能被透析除去
。
（2）抗体以外的血清蛋白与荧光素结合形成荧光素脲蛋白，可与组织成分结合。
（3）除去检查的抗原以外，组织中还可能存在类属抗原（如Forssman氏抗原），可与组织中特异性抗原以外之之相应抗体结合。
（4）从组织中难于提纯抗原性物质，所以制备的免疫血清中往往混杂一些抗其他组织成分的抗体，以致容易混淆。
（5）抗体分子上标记的荧光素分子太多，这种过量标记的抗体分子带过多的阴离子，可吸附于正常组织上而呈现非特异性染色。
（6）荧光素不纯，标本固定不当等。 二、消除非特异性染色的方法
消除荧光抗体非特异性染色的方法应根据产生的原因采取适当的方法，常用的方法有以下几种：
（一）动物脏器粉末吸收法
常用肝粉（猪、大白鼠或小白鼠），其次是骨髓粉、鼠脑粉和鸡胚粉等。每毫升荧光抗体中加入肝粉50～100mg,在离心管中充分混匀，在室温中振动2h，4℃中过夜，再搅拌10min，高速离心（3000～15000r/min）30min，1～2次后，即可使用其上清液。吸收一般应在临用前进行，吸收后之荧光抗体保存冰箱中勿超过2周。染色应作吸收前后之比较，吸收时可先用缓冲盐水将组织干粉浸湿，离心（3000～15000r/min）30min，除去上清液，再加入荧光抗体进行吸收，以免消耗过多的抗体。
肝粉或新鲜细胞吸收是一种非特异性的消除方法，对荧光抗体的荧光色素和蛋白都有吸附作用。如检查组织中的病毒抗原时，也可用相同的组织干粉或匀浆沉淀物吸收之。
用脏器肝粉吸收对荧光抗体损失较多，如果根据Hiramotos氏等的方法将组织的20%生理盐水匀浆液，用生理盐水洗2～3次，12000r/min
10min离心沉淀，用其沉淀物吸收其荧光抗体即能完全达到目的，京极方久氏认为这样吸收对荧光抗体几乎没有损失，他们常用此法，效果甚佳，吸收后放置一周左右，用时有必要再吸收一次。
【肝粉的制法】
（1）将若干只小白鼠或大白鼠放血杀死，取出肝脏，用生理盐水洗2～3次，除去血液，剥掉表面的结缔组织的脂肪。
（2）剪碎，用生理盐水反复洗涤至无血色止，然后再加生理盐水少许，用组织捣碎机或匀浆器作成匀浆。
（3）将肝匀浆装入离心管内（1/3左右），交换地用2～3倍量生理盐水和丙酮反复洗涤各三次，至上清无血色止，每次完毕先用2000r/min离心沉淀15 min后，再除去上清液。
（4）最后用丙酮洗涤肝浆，再用布氏漏斗过滤，或离心沉淀，将沉淀物平铺在洁净的玻璃板上，37℃烤干（过夜）。
（5）在乳钵中充分研磨，用120目铜筛筛选过后，分装，密封，低温干燥保存。
2006-12-22 13:24 wifgw
二）透析法
荧光素如FITC分子可以通过半透膜，而蛋白质大分子不能透过，可将未与蛋白结合的荧光素透析除去。
（1）将标记完毕的荧光蛋白液装入一透析袋或玻璃纸袋内，液面稍留空隙，紧扎。
（2）浸入0.02mol/pH
7.1～7.4的PBS中（悬于大于标记物体积约50～100倍的PBS内），在4℃中透析，每日更换3～4次PBS，约5～7天，透析液中无荧即可（在荧光光源照射下）。
（三）葡聚糖凝胶G-50柱层析法
除游离荧光素可用2×46cm柱层析法，详细方法参阅第二章。加入荧光抗体15～18ml（按床体积的5%～10%加样），使其缓慢渗入柱内，待即将全部入柱时，加入PBS少许，关闭下口，停留30～40min ，使游离荧光充分进入细筛孔中，然后再接通洗脱瓶开始滴入洗脱液。加入洗脱液一定量后，荧光抗体即向下移行，逐渐与存留于上端的游离荧光素之间拉开明显的界线，随着大量洗脱液的不断加入，二者分离距离越来越大，荧光抗体最先流出，分前、中、后三部分收集，测F/P比值，合格者合并，浓缩，分装。洗脱液用20%磺基水杨酸测定蛋白（发生沉淀反应），继续洗脱，游离荧光素则相继被洗脱下来，至洗脱液中无蛋白和荧光素后，此层析柱即可再用。
若用以除去荧光抗体中的游离荧光素和硫酸铵等盐类，可先在过柱前透析一夜，否则，NH4+太浓，在蛋白未完全洗脱时即出现NH4+，因而影响提纯与回收蛋白，一般待洗脱液出现蛋白时，即进行收集，之后出现SO4++（用1%BaCl2检查发生白色沉淀）。最后是NH4+，（用纳氏试剂检查呈黄棕色沉淀），待洗脱液无SO4++及NH4+后可再用。
如仅用小量荧光抗体，可用1×20cm的柱层析柱，取2g Sephadex G-50装柱，即可过滤2～3.5ml荧光抗体。
（四）DEAE纤维素柱层析法
标记过多或过少荧光素的抗体分子可用DEAE-纤维素柱层析法除去。方法如下： DEAE-纤维素柱的装柱，洗脱、再生方法等与提纯IgG方法相同。装柱所需DEAE-纤维素量以干重每克交换20～50mg标记蛋白量为宜
。常用梯度洗脱法如下：
（1）层析柱用0.01mol/L、pH7.2PB平衡，标记物上柱后，先用0.01mol/L、pH7.2PB洗脱，洗出无色或淡绿色液体，洗脱液量（根据床体积大小每梯度乘3），然后依下列各种离子强度洗脱液，
分别洗脱和收集：
0.01mol/L、pH7.2PBS（0.05mol/L NaCl）……洗脱部分1。
0.01mol/L、pH7.2PBS（0.01mol/L NaCl）……洗脱部分2。
0.01mol/L、pH7.2PBS（0.02mol/L NaCl）……洗脱部分3。
将此三部分收集液（每管5ml）分别测定其F/P比值，0.05mol/L NaCl pH7.2PB洗脱液280nm光密度高峰管合并，浓缩保存备用。因这部分非特异性染色荧光最少，是比较好的荧光抗体。其他两部分可以废弃。
（2）柱上吸附的过度标记蛋白可继续增加NaCl的浓度至
2.0mol/L洗脱完。
经过DEAE-纤维素层析后的标记抗体，其抗体量一般约损失50%，因此有些要求不太高的抗体，如抗细菌荧光抗体，不一定要这样处理，可用染色效价测定的稀释法除去非特异性染色。
（五）荧光抗体稀释法
先测定荧光抗体特异性染色与非特异性染色的效价，若二者效价相差较大，则可将荧光抗体稀释至一临界浓度，使特异性染色呈阳性，而使非特异性染色保持阴性，稀释方法和染色效价测定方法相同。
（六）纯化抗原法
用各种方法提纯单一成分的抗原是产生单价特异性抗体的最主要条件。近代免疫化学技术（免疫吸收法）和柱层析法等提供了很大的可能性，可参考有关专著。
（七）纯化抗体法---免疫吸收法
例如抗IgA血清的纯化方法---免疫吸收法。如分泌型IgA（ SIgA）抗原纯度不高，所制的抗血清常与IgG呈交叉反应，为此需要吸收，常采用纯化的人IgG戊二醛聚合物加以吸收纯化。方法如下：
1．人IgG聚合物的制备 在5ml含40mg/ml人IgG的0.1mol/L pH7.0磷酸缓冲溶液中，加入2.5%戊二醛溶液1ml，边加边搅，5min即出现混浊，逐现大块胶块，放置30min后，用研钵将凝胶磨细，继用1.0mol/L pH7.0磷酸缓冲溶液反复洗涤3次，末次加蒸馏水至20ml，即为人IgG聚合物悬液。
2．免疫吸收法 将待吸收的抗SIgG血清加入待量IgG聚合物悬液，置室温搅拌60min,离心沉淀，上清液即稀释1倍的纯化抗SIgA血清。如用IgG聚合物作少量分次吸收，其效果更好。
（八）伊文氏蓝（Evans blue）衬染法
用0.01%伊文氏蓝的0.01mol/L pH7.2PBS稀释荧光抗体，可将背景细胞和组织染色，呈红色荧光，与特异性黄绿色荧光形成鲜明的对比，减少了非特异性荧光，宜作常规应用。伊文氏蓝一般先配成1%溶液，保存于4℃，用前再稀释至0.01%用以
和然释荧光抗体。
此外，还可以用胰酶消化组织切片或用10%牛血清蛋白封闭法等消除非特异性染色，提高特异性染色。
3、II型胶原染色原理和方法
直染料在溶液中被纤维吸附到表面，然后不断向纤维的无定形区扩散，与纤维大分子形成氢键和范德华力的结合。其派生的染料有直接耐晒染料和直接铜盐染料。染料染色时，为缩短染色时间，染色温度采用80一90℃
4、您好！卡尔科弗卢尔荧光染色剂（Calcofluor)对几丁质进行染色的具体操作步骤您知道吗？谢谢指导！
你可以去印染在线看看，哪里有好多文章看以看的，应该有这类的文章。另外网站也有专家回答问题。你可以试试咯。
5、免疫荧光染色的详细步骤及应注意的细节
免疫荧光染色方法快捷,灵敏.
标本是冰冻切片,还是石蜡切片?切片的厚薄?影响到一抗孵育的时间.
选用较佳的一抗的工作浓度.
二抗需A液B液在室温混合15分钟后再用.
标本需保存在-20度.
6、sigma的33258荧光染料怎么用
使用方法（仅供参考）：
1. 用PBS或合适的缓冲液制备10～50µM Hoechst 33258染色液。
2. 固定的细胞或组织染色：
对于固定的细胞或组织样品，固定后，适当洗涤去除固定剂。随后如果需要进行免疫荧光染色，则先进行免疫荧光染色，染色完毕后再按后续步骤进行Hoechst33258染色。如果不需要进行其它染色，则直接进行后续的Hoechst 33258染色。
a) 对于贴壁细胞或组织切片：加入适量Hoechst 33258染色液，覆盖住样品即可。对于悬浮细胞：至少加入待测染色样品体积3倍的染色液，混匀。室温放置3-5分钟。
b) 吸除Hoechst 33258染色液，用TBST、PBS或生理盐水洗涤2-3次，每次3-5分钟。
c) 直接在荧光显微镜下观察或封片后荧光显微镜下观察。激发波长350nm，发射波长460nm。
3. 活细胞或组织染色：
a) 细胞培养物中加入适量Hoechst 33258染色液，约1/10细胞培养基体积，必须充分覆盖住待染色的样品。通常对于六孔板一个孔需加入1ml染色液，对于96孔板一个孔需加入100μl染色液。
b) 在 37℃培养细胞 10～20 分钟。
c) 用 PBS或合适的缓冲液洗细胞两次。
d) 直接在荧光显微镜下观察或封片后荧光显微镜下观察。激发波长350nm，发射波长460nm。
7、求助hoechst33258染色步骤
7.If staining for extracellular markers (i.e.: Sca-1, Lineage, c-kit, etc) then resuspend cells in 300mL of PBS, and stain cells on ice in dark for 30 minutes with antibodies. (N.B.: You can not use a PE antibody, as Pyronin Y fluorescence is in this channel, and you can not use a UV antibody, as Hoechst is in this channel.)
8.After staining, or if just spun down w/o staining, resuspend in 2mL of 5% paraformaldehyde.
9.Samples must sit at least overnight in 5% PFA in fridge, can sit for 1-2 weeks fine too.
10.When you want to add PY, make 1:100 dilution then add 10uL to each mL PFA (so, final dilution is 1:1000 from stock – but for some reason, it looks better if dilution is done in this stepwise fashion rather than dye added directly to cells from stock!)
11.Put tube in fridge for 30 minutes to incubate w/ PY.
12.Spin down, resuspend cells in 500mL 5% PFA, analyze.
13.When analyzing, remember that antibody fluorescence is log scale, PY fluorescence and Hoechst fluorescence are linear scale.
JianH：荧光显微镜可以配备有三种荧光：blue，green，UV。Hoechest只能用UV.
icepiao：Hoechst染色好像就是很浅，我曾用来检测过支原体，不知道你当时又没有固定细胞。
heartbeyond：我没有固定细胞，因为我要得到的是活的细胞，文章上看到的改种染色，颜色不是很浅，可是我的染色结果不是浅的问题，是踪影皆无，新买了染色剂，还是不行。会不会是荧光显微镜的问题
shifang99：我的方法和你差不多，但是染的效果很好，细胞核看得很明显的，而且半个月后，还是很清楚的。估计可能是你的显微镜的问题。我用的好象是蓝光啊。你再看看。你可以看看有没有其他的荧光标记物，染一下，做个对照检查一下。
wnwnwang：我也请教一个问题，由于我要到别的地方观察，我不想消化细胞后进行染色，而是直接在六孔板里进行染色，pbs洗，然后观察计数。不知道这样对贴壁的细胞而言，染色是否会不够充分，效果如何？
altbenair：第一次做检测凋亡，也不知道凋亡细胞应该是什么样的，而且我们的条件差，手工拍照。我们的荧光显微镜只有三种激发光颜色 不能调激发光波长。说明书是这样写的：透镜转盘位置，激发光颜色，适用荧光素。WB 蓝 FITC(绿色荧光) WG 绿 TRITC（红色荧光） WU 紫外 自发荧光
用WB WG 只有少数发绿色 和红色荧光的地方，用WU 可以清楚看到很多细胞 。
drake015：细胞核基本正常，属于正常细胞核，光线太亮。
照碧云天hoechst染出来的说法，只要核染出来比正常核小，而且亮度高就是凋亡细胞。他们的技术人员都在国外，没人能够提供详细的解释。都是染核的染料，结果应该差不多，不过一般我们作不出那么典型的图片。可是你那张图也实在不太象细胞核。
belgern: 观察物诱导肿瘤细胞的凋亡，仅只做光镜和荧光显微镜能说明问题吗？用Hoechst33258染色检测培养的细胞凋亡的具体方法是怎样的？涂片的载波片需特殊处理吗？
drake015: 最好再加一种流式计数或其他的方法。形态学加定量比较理想
belgern: 但如果我不想做细胞爬片，选择hoechst33342染色（因hoechst33342可以对活细胞直接进行染色），能否直接将染料加入培养液中，染色10min，弃培养液和染料，4%福尔马林4℃固定10min,弃固定液,直接将培养瓶放在倒置的荧光显微镜下观察呢?
drake015:呵呵，思路这么清楚摸索一遍有何妨？祝你成功！33258也可染活细胞的，我做过，33342没用过。有倒置显微镜我想可以直接染色。不过为什么不倒掉培养液再染？染料是固体？我想还是现配成溶液比较好。不管怎么说试验不难，可以试试看。
非关凋亡的讨论
future04：实验需要标记干细胞，有人说可以用Hoechst标记，可是我查的大部分使用来标记凋亡的，究竟Hoechest可以标记细胞吗？能维持多久？
dp：最好别用他来标记移植细胞,体内虽然可维持很长时间,但后期的污染现象(染周围的细胞)特别严重,根本无法分析你的结果.切记!我实验失败的严重教训.
cardiohong: 我的研究方向是干细胞移植，现在实验已经完成。主要是在体外将移植细胞以hoechst33342染色，而后植入体内。2周后取标本复查，荧光很好，而且非常密集；但4周后再检查的时候，荧光却踪影全无。我对这种现象很难解释。可能的原因不外乎：1、细胞死亡，2、细胞排出染料，3、染料荧光自然衰减，或发生猝灭。但查了查有关资料，一直没查到hoechst33342的荧光寿命，以及在什么条件下会猝灭。
midas: cardiohong 我对您的问题谈一些我的看法（个人观点，欢迎讨论），
首先我对细胞（包括干细胞）移植后的存活问题始终存有疑虑：且不说移植后的免疫排斥问题，我们谈谈细胞的外部生存条件：培养细胞在体外有充足的营养供应，有它适合生存的培养基及介质，然而到了体内它周围有什么？条件自然比体外要差的多。所以我认为不解决移植细胞在体内的存活问题，那么移植的可靠性和实用性就会大大！
我曾经用绿色荧光蛋白（一种标记细胞浆的荧光染料）标记嗅鞘细胞（体外观察很好），但是把它移植到正常的脊髓中，confocol结果发现一堆绿色的乱七八糟的小渣子，根本没有细胞的形态，但是用hoechst33342标记的，仍然有不少表面上显示正常的核的结构。从这一点上我们可以得出－－这时细胞的状态并不正常！虽然它们的核仍然完整。
下来谈谈hoechst的问题，hoechst是一种核酸特异性染料，与A－T键优先结合。因此在正常情况下hoechst荧光寿命的时间应该是较长的，直到A－T键被破坏。所以说荧光消失的问题就很可能是细胞死亡后，被周围的巨噬细胞吞噬消化掉的结果（如果没有完全消化，就仍然有荧光的显示）。
BlueSadNess: 首先Hoechst 33342 effulx是什么意思？是Hoechst 33342 拒染吗？
还有为什么干细胞（至少精原干细胞）会表现Hoechst 33342 efflux的特性？其原理是什么？
qjzhou2000: 不是拒染，而是能将染料泵出，所以在过流式的时候绘出现side-population的现象。至于具体原因还未明确，不过有些文章可以参考！
The ABC transporter Bcrp1/ABCG2 is expressed in a wide variety of stem cells and is a molecular determinant of the side-population phenotype