rnai技术与骨质疏松

1、RNAi 的原理是什么?

rna干扰的分子抑制机制的三种方式及原理
转录抑制

与有关的dsrna及蛋白质可参与染色质的修饰作用，使其中的组蛋白和dna发生甲基化作用，使相应基因不能被转录，从而导致受阻基因不能表达。这种在转录水平上阻断基因功能，使基因沉默的rnai方式被称为转录基因沉默(transcriptional
gene
silencing,tgs)。这种现象先在植物中得到证实,但是在哺乳动物中是否存在仍有争议。2004年svoboda等研究表明，在小鼠卵母细胞中，通过rnai引起靶基因表达沉默的长dsrna不能引起相应dna区域从头合成dna的甲基化。morris等也于同年得出实验结论，针对内源基因启动子的sirna能够引起其区域内cg岛以及组蛋白h3k9的甲基化，从而在转录水平抑制基因的表达。
转录后抑制
不同来源的dsrna通过各种转基因技术转入植物、线虫或哺乳动物细胞内，、被切割产生sirna片断，再由合成的risc切割靶mrna从而阻断基因表达。这种基因能正常转录成mrna，但mrna因被降解使基因功能被阻断，这种rnai方式叫做转录后沉默(post
transcriptional
gene
silencing,ptgs)。sirna对靶mrna降解具有序列特异性，只能引起同源mrna降解，如果sirna与mrna有一个bp不配对，rnai作用就极大降低，如果两者有4个bp不配对，就不能产生rnai。
翻译抑制

grishok等在研究rnai时，发现在细胞中在细胞中存在内源性小片段单链rna(ssrna)，其长度也在21～25
nt之间，这种ssrna可与mrna的3′非翻译区(3′utr)特异性地结合，从而抑制mrna的翻译和相应的功能蛋白质合成。这种小片段的ssrna叫做strna(small
temporal
rna)。ssrna的形成是因为当rna的大小为70～80
nt时，容易形成双链的茎环状结构，其双链茎的长度正好在21～25
nt之间，这样的双链结构易被dicer酶识别并切割成strna，由strna抑制翻译。这种方式的rnai也作用于转录后形成的mrna，它在调节生物细胞内基因的表达、自身的发育方面起着重要的作用。

2、求RNAi技术和TALEN技术的优缺点

其实TALEN很好，很新，比慢病毒还要好，而慢病毒比RNAi好。
shRNA可以在干细胞，神经细胞，胚胎干细胞等难转染的细胞中高效率的蛋白，他的启动子等都是外源的，表达蛋白的翻译后修饰可能会不够真实，而TALEN可以更好的弥补他的缺陷。第一，TALE靶点识别模块构建。TAL的核酸识别单位为重复34个恒定氨基酸序列，其中的12、13位点双连氨基酸与A、G、C、T有恒定的对应关系，即NG识别T，HD识别 C，NI识别A，NN识别G。为获得识别某一特定核酸序列的TALE，只须按照DNA序列将相应TAL单元串联克隆即可。由于物种基因组大小的不同，选择的特异序列长度也不同，对于哺乳类动物包括人类，一般选取16-20bp的DNA序列作为识别靶点。第二，
TALEN的基因敲除
将识别特异DNA序列的TALE与内切核酸酶FokI偶联,可构建成剪切特异DNA序列的内切酶TALEN。而且FokI需形成2聚体方能发挥活性，大大减少了随意剪切的几率。在实际操作中，需在目标基因的编码区或外显子和内显子的交界处选择两处相邻（间隔13-22碱基）的靶序列（一般16-20个碱基）分别进行TAL识别模块构建。将这两个相邻靶点识别模块（分别）融合克隆到FokI的N-末端，形成真核表达载体，得到TALEN质粒对。
将TALEN质粒对共转入细胞中可实现靶基因敲除。TALEN质粒对共转入细胞后，表达的融合蛋白，分别与靶位点特异结合，由于两个TALEN融合蛋白中的FokI临近， 形成二 聚体，发挥非特异性内切酶活性，在两个靶位点之间剪切DNA，形成DSB（Double-Strand Breaks）,诱发DNA损伤修复机制。细胞可以通过NHEJ（Non-homologous End Joining）修复DNA，在此修过程中或多或少地删除或插入了一定数目的碱基，造成移码，形成目标基因敲除突变体
TALEA的转录激活
将识别特异DNA序列的TALE与转录因子激活区域VP64(VP64 Activation Domain )融合，可构建成识别启动子上特异DNA序列的转录激活因子TALEA. 在实际操作中，需在目标基因的启动子上游选取靶序列（一般12-18个碱基），构建TAL识别模块。将识别模块TALE融合克隆到VP64的N-末端，形成真核表达质粒TALEA。将TALEN质粒转入细胞中，表达的融合蛋白结合启动子附近的特异DNA序列，并通过VP64激活区域与Pol II 结合，从而激活基因的转录，提高了内源目标基因的表达。

3、什么是RNAi技术

RNAi技术是指利用体外合成的短双链RNA（21-23个核苷酸）抑制细胞内特定基因表达的技术，是转录后基因沉默的一种研究基因功能的有力工具。

4、RNAi有哪些发现价值？

RNAi首先由Fire等1998年发现于秀丽新小杆线虫（emphasis：role=italicCaenorhabditis：elegansemphasis），他们将dsRNA注入线虫体内后可抑制序列同源基因的表达，并证实这种抑制主要作用于转录之后，所以又称RNAi为转录后基因沉默（postt：ranscriptional：gene：silencing，PTGS）。随后人们陆续在果蝇emphasis：role=italic（Drosophila）emphasis、锥虫（emphasis：role=italicTrypanosomesemphasis）、涡虫（emphasis：role=italicPlanariaemphasis）、斑马鱼（emphasis：role=italicZebrafishemphasis）、拟南芥（emphasis：role=italicArabidopsis：thalianaemphasis）、大小鼠和人体内发现了RNAi现象，遗传学研究表明RNAi是真核生物中一种普遍存在且非常保守的机制，与真核细胞中许多重要生物学过程密切相关。随后，RNAi技术被成功地应用到某些哺乳动物细胞中，展示了此项研究更为广阔的应用前景。

5、什么是RNAi?

 rnai指RNA干扰

RNA干扰（RNA interference, RNAi）是指在进化过程中高度保守的、由双链RNA（double-stranded RNA，dsRNA）诱发的、同源mRNA高效特异性降解的现象。基因沉默，主要有转录前水平的基因沉默(TGS)和转录后水平的基因沉默(PTGS)两类:TGS是指由于DNA修饰或染色体异染色质化等原因使基因不能正常转录;PTGS是启动了细胞质内靶mRNA序列特异性的降解机制。有时转基因会同时导致TGS和PTGS。

(5)rnai技术与骨质疏松扩展资料：

1992年，罗马诺（Romano）和Macino也在粗糙链孢霉中发现了外源导入基因可以抑制具有同源序列的内源基因的表达。

1995年，Guo和Kemphues在线虫中也发现了RNA干扰现象。

1999年，Hamilton等首次在PTGS植株中发现了长度为25nt的RNA中间产物。2000年，Zamore和Hammond等使用体外培养的果蝇细胞进行研究发现，外源性dsRNA通过耗能过程降解成21-23nt的小干扰RNA（small interfering RNA，siRNA）引发RNAi。

6、rnai技术在分子生物学领域的应用前景和存在问题

基因功能研究药物靶点筛选，细胞信号通路分析等领域的重要技术哈。现在文献也比较多。需要的话我发你。基因表达技术和基因沉默技术作为基因功能研究中最常用的手段，已经成为生物学、医学和药物研发中的主流技术。分体外（化学siRNA）、体内（质粒转染、病毒包装）实验路径。其中，以病毒载体为媒介的基因表达和基因沉默技术（可以方便地为您提供包括基因调取、载体设计、载体构建、病毒包装、细胞转基因等在内的整体实验技术服务，实现基因插入、基因敲除、基因上调、基因下调、可控及组织特异性表达等目的。）已经发展成为当今炙手可热的基因功能研究手段。1. 体外化学合成siRNA: 对于瞬时基因沉默试验，容易获得高水平的瞬时沉默效果，特异性强，对细胞或者组织的毒副作用小、可大规模制备、操作简便等优点，特别适用于基因靶位点不确定情况下，进行siRNA有效片段的筛选。干扰效率是否明显与靶点的选择、实验条件的优化、实验操作等紧密相关。2. 体内表达-质粒转染：通过构建真核表达质粒，荧光蛋白协同表达示踪目的基因的表达情况，及基因敲减效果的相关检测。转染效率取决于细胞类型及转染条件和实验方法。局限是很多细胞用质粒转染效率不高，以致有的都没法检测沉默效果。3. 体内表达-病毒转染：在转染效率大于80%的情况下，干扰效率可达70%。腺病毒或慢病毒RNAi可在转染细胞，如神经细胞、悬浮细胞、干细胞等难转染的细胞中进行目的基因的沉默。慢病毒RNAi后续可转染靶细胞，筛选混合稳定细胞株（通过抗生素筛选，实现目的基因在靶细胞的基因组中的稳定整合）就是实验周期相对长了点，从设计靶点到最后病毒包装后的滴度测定，后续检测要100多个工作日。实验操作上也相对技术含量高了。^.^

7、简述rnai干涉基本原理

RNAi (RNA interference) 即RNA干涉,是近年来发现的在生物体内普遍存在的一种古老的生物学现象,是由双链RNA（dsRNA）介导的、由特定酶参与的特异性基因沉默现象,它在转录水平、转录后水平和翻译水平上阻断基因的表达.RNAi 广泛存在于从真菌到高等植物、从无脊椎动物到哺乳动物各种生物中.同时作为一项新兴生物技术,RNAi有着广泛的应用前景.本文主要论述了RNAi的发现、RNAi 的机理、RNAi的作用特点以及RNAi 的应用前景.
1.RNAi的定义
目前对RNAi (RNA interference)的定义有很多种,不同的资料对其定义的侧重点也不尽相同,如果将RNAi看作一种生物学现象,可以有以下定义：① RNAi是由dsRNA介导的由特定酶参与的特异性基因沉默现象,它在转录水平、转录后水平和翻译水平上阻断基因的表达.② RNAi是有dsRNA参与指导的,以外源和内源mRNA为降解目标的转基因沉默现象.具有核苷酸序列特异性的自我防御机制,是一种当外源基因导入或病毒入侵后,细胞中与转基因或入侵病毒RNA同源的基因发生共同基因沉默的现象.
如果将其作为一门生物技术,则定义为：① RNAi 是指通过反义RNA与正链RNA 形成双链RNA 特异性地抑制靶基因的现象,它通过人为地引入与内源靶基因具有相同序列的双链RNA(有义RNA 和反义RNA) ,从而诱导内源靶基因的mRNA 降解,达到阻止基因表达的目的.② RNAi是指体外人工合成的或体内的双链RNA（dsRNA）在细胞内特异性的将与之同源的 mRNA降解成21nt～23nt 的小片段,使相应的基因沉默.③ RNAi是将与靶基因的mRNA 同源互补的双链RNA(dsRNA ) 导入细胞,能特异性地降解该mRNA ,从而产生相应的功能表型缺失,属于转录后水平的基因沉默(post - transcriptional gene silence ,PTGS).
各种不同定义虽然说法不同,但所描述事实是大体相同的,简单地可以说,RNAi就是指由RNA介导的基因沉默现象.

8、什么是RNAi？

近年研究表明，将与mRNA对应的正义RNA和反义RNA组成的双链RNA（double：stranded：RNA，dsRNA）导入细胞，可以使mRNA发生特异性的降解，从而导致相应的基因沉默，这种转录后基因沉默机制（post-transcriptional：gene：silencing，PTGS）被称为RNA干扰（RNA：interference，RNAi）。RNAi是真核生物中一种非常保守的机制，它与协同抑制（cosuppression）、转座子沉默（transposon：silencing）以及发育等许多重要的生物学过程密切相关。RNA干扰依赖于小干扰RNA（small：interference：RNA，siRNA）与靶序列之间严格的碱基配对，具有很强的特异性，涉及众多基因和蛋白复合物，构成了一个以小RNA为核心的真核基因表达调控系统，它可以在染色质水平、转录水平、转录后水平和翻译水平参与基因表达的调节。

RNA干扰技术为人们迅速、准确地剖析基因的功能，分析基因之间错综复杂的联系和相互作用提供了极为有用的工具，同时也为人们预防和治疗癌症和病毒疾病提供了新的思路。RNAi是由双链RNA分子在mRNA水平关闭相应基因表达或使其发生沉默的过程，可以抑制不同类型细胞的靶向基因表达，用特异性的抗体几乎检测不到靶向基因所表达的蛋白质，因此，RNAi技术又被形象地称为基因敲除（knock-down）或基因沉默（gene：silencing），是一种典型的转录后基因调控方法，因此又称转录后基因沉默（PTGS）。

RNAi现象广泛存在于生物界中，它在真菌中被称为quelling，在拟南芥、烟草等植物中被称为PTGS或共抑制（co-suppression），在无脊椎动物如果蝇、水螅、线虫以及脊椎动物斑马鱼、小鼠等动物界中被称为RNAi，它可能是生物界，包括植物和动物等普遍存在的一种古老、保守而又极其重要的遗传行为。

9、RNAi的技术有哪些应用？

虽然对RNAi的研究只有短短几年时间，但RNAi技术已经快速被应用于多个领域，目前在植内物上主容要用于基因功能研究。

随着基因组测序技术的快速发展，科学家急需一种新的、快速的方法解读基因的功能和基因的表达机制以及基因之间的相互关系。而RNAi技术已成为解决这些问题的重要手段。与其他方法相比，RNAi技术在基因功能研究上有其独特的优点：①简单易行，容易开展；

②与基因敲除（gene：knockout）相比实验周期短，成本低；

③与反义技术相比具有高度特异性和高效性；

④可进行高通量（high-throughout）基因功能分析。

因此，RNAi技术的诸多优点使它很快便被作为研究基因功能的主要方法。在临床应用上，RNAi机制可抑制外源和内源有害基因的表达，如利用RNAi技术把与病毒基因具同源性的siRNA引入感染细胞将会抑制病毒的增殖，这为相关疾病的治疗提供了新的思路。

另外，利用RNAi技术还可以高效、特异、快速的抑制细胞内癌基因的表达。可以预测，RNAi技术将会为癌症和病毒疾病治疗带来突破。