骨髓树突状细胞提取方法

1、如何把外周血中的树突状细胞分离，纯化出来

目前用Ficoll密度梯度离直接离纯化外周血单核细胞
:
1.　短管加入适量淋巴细胞离液
2.　取肝素抗凝静脉血与等量Hank's液或RPMI1640充混匀用滴管沿管壁缓慢叠加于层液面注意保持清楚界面水平离2000rpm×20钟
3.　离管内三层层血浆Hank's液层主要红细胞粒细胞层淋巴细胞离液、层界面处单核细胞主白色云雾层狭窄带(图)单核细胞包括淋巴细胞单核细胞外含血板

4.　用毛细血管插云雾层吸取单核细胞置入另短管加入5倍体积Hank's液或RPMI16401500rpm×10钟洗涤细胞两
5.　末离弃清加入含10％牛血清RPMI1640重悬细胞取滴细胞悬液与滴0.2％台盼兰染液混合于血球计数板计数四格内细胞总数
单核细胞浓度(细胞数／1毫升细胞悬液)＝
　4格内细胞总数
　──────────　×　104×2(稀释倍数)
4
6.　细胞力检测：死细胞染兰色细胞着色计数200淋巴细胞计算细胞百率
　细胞数
　细胞百率＝──────　×100％
　总细胞数
用本离PBMC纯度90％收获率达80～90％细胞百率95％

2、树突状细胞的粗面内质网新合成的MHCⅡ类分子以下列哪种形式存在？

树突状细胞是一类形状不规则的非单核吞噬系统细胞，特点是胞浆有许多长突起呈触须状，使整个细胞的形态象一个蜘蛛，树突状细胞分散于全身的上皮组织和实质性器官，其细胞数量不超过局部细胞总数的1%；也可迁移到血液和淋巴，其数量不超过血液有核细胞总数的0.1%在不同组织中，树突状细胞有不同名称，例如人血液中的树突状细胞、皮肤中的L a n g e r ha n s细胞、淋巴液中的帆状细胞、外周淋巴器官中胸腺依赖区的并指状细胞等。树突状细胞来源于骨髓的前体细胞，与单核吞噬细胞系统有不同的祖细胞，但是对其发育过程目前尚了解不多。
树突状细胞的呑噬能力较弱，但细胞表面积大，且有丰富的M H Cl l类分子，所以捕获抗原和递呈抗原的能力很强。树突状细胞有运动能力，所以能在休内搜寻罕见的特异性T细胞经递呈抗原，因此树突状细胞在启动免疫应答方面有重要的意义。
另外，淋巴结皮质区内含有较多所滤泡树突状细胞，这类细胞不表达M HC l l类分子，不能向TH递呈抗原；但富含F c受体，能够通过结合抗体以免疫复合物的方式捕获抗原。所以F D C与B细胞的活化和再次抗体应答相关

3、怎么用免疫磁珠的办法提取肠道固有层 和肠系膜淋巴结 的树突状细胞。树突状细胞的原代培养方法。

细菌感染后肠道固有层树突状细胞，巨噬细胞分别有什么变
:小肠固有层是肠道免疫系统主要的效应部位,内含大量的巨噬细胞、CD4~+T细胞和树突状细胞等免疫细胞,在早期抵抗肠道病原菌过程中起着关键作用。

4、工作细胞树突状细胞是什么？

树突状细胞是由清水茜所创作漫画《工作细胞》及其衍生作品的登场角色。它是重要的吞噬细胞和专职抗原提呈细胞，驻扎在大树中，负责将侵入身体的细菌、病毒感染细胞等的残骸作为抗原提供给其他的免疫细胞的工作。成功的活化了初始T细胞。

动画中的他几乎不外出活动或获取抗原，而是被动地获得、保管、和分发抗原信息。从某种意义上，他所居住的大树才是树突状细胞真正的化身。

树突状细胞的分类

常规树突状细胞(Conventional Dendritic Cell, cDC)，以前也称作骨髓树突状细胞(Myeloid Dendritic Cell, mDC)，与单核细胞相似。

这些细胞又被分为两种：更常见的mDC-1，起T细胞激活者的作用；和极少见的mDC-2，可能直接参与对抗创口感染。cDC分泌白细胞介素-12（详见辅助T细胞）。

浆细胞样树突状细胞(Plasmacytoid dendritic cell, pDC)与浆细胞外观类似，但具有一些常规树突状细胞的特性。pDC能分泌大量干扰素-α。

它们分别来自两种不同的单能干细胞（只能分化为一种细胞的干细胞），但都来自于骨髓。常规树突状细胞可能还能分化自单核细胞。

以上内容参考 网络——树突状细胞

5、骨髓诱导树突状细胞可以看见集落为什么流式做不出来

可能的原因很多，你的抗体不好使，染色方法有问题，诱导以后，所希望表达的抗原没有表达，等等，需要一一解决。

6、请教树突状细胞的培养经验

树突状细胞的培养，目前还没有传代的细胞柱，大家一般采取的是两种办法，一种是从组织分离，主要应用的是细胞磁珠经过纯化，然后配取合适的培养基进行诱导培养。
另一个就是单纯的联合诱导培养，我就是采用这个方法。具体的protocal如下：C57BL/6小鼠，6～8周龄，雌性，体重18～20g，购自北京军事医学科学院动物中心。细胞因子rmGM-CSF及rmIL-4为美国Peprotech公司产品。CD11C+细胞磁珠分离纯化试剂盒为德国Milentyi公司产品。
1． 采用断头术处死小鼠，在75％的酒精中浸泡2－3min后，置于无菌平皿中，剪开皮肤。取出双侧股骨，用无菌的生理盐水（或RPMI－1640代替）刷洗2－3次后剪开骨两端，用1ml的注射器抽取RPMI－1640液，将骨髓细胞冲入15ml离心管中。
2． 将骨髓细胞轻轻吹打，使细胞完全悬浮，静置五分钟，然后转入另一个15ml离心管中，离心，1200rpm，10min 。
3． 弃上清，细胞沉淀按1：10加入Tris-NH4CL缓冲液，轻轻吹打混匀，室温放置五分钟。
4． 离心后，弃上清，细胞沉淀用RPMI－1640洗涤两遍。
5． 细胞计数，用RPMI－1640调整细胞浓度为0.5-1×105 ／ml，置于六孔培养板中，每孔2ml。
6． 37℃，5％CO2，饱和湿度下贴壁2－3h
7． 吸弃上清，用37℃预温的RPMI－1640轻轻洗去非贴壁的细胞，每孔加入2ml的完全培养液继续培养。
8． 隔日半定量换液，小心弃去悬浮细胞，轻轻转动培养板，防止细胞凝集。第七天收集悬浮细胞，做相关的实验。
按照如此方法培养的细胞效果相当好。一般流式检测可以达到80％的纯度。

7、如何把外周血中的树突状细胞分离纯化

树突状细胞的培养，目前还没有传代的细胞柱，大家一般采取的是两种办法，一种是从组织分离，主要应用的是细胞磁珠经过纯化，然后配取合适的培养基进行诱导培养。
另一个就是单纯的联合诱导培养，我就是采用这个方法。具体的protocal如下：C57BL/6小鼠，6～8周龄，雌性，体重18～20g，购自北京军事医学科学院动物中心。细胞因子rmGM-CSF及rmIL-4为美国Peprotech公司产品。CD11C+细胞磁珠分离纯化试剂盒为德国Milentyi公司产品。
1． 采用断头术处死小鼠，在75％的酒精中浸泡2－3min后，置于无菌平皿中，剪开皮肤。取出双侧股骨，用无菌的生理盐水（或RPMI－1640代替）刷洗2－3次后剪开骨两端，用1ml的注射器抽取RPMI－1640液，将骨髓细胞冲入15ml离心管中。
2． 将骨髓细胞轻轻吹打，使细胞完全悬浮，静置五分钟，然后转入另一个15ml离心管中，离心，1200rpm，10min 。
3． 弃上清，细胞沉淀按1：10加入Tris-NH4CL缓冲液，轻轻吹打混匀，室温放置五分钟。
4． 离心后，弃上清，细胞沉淀用RPMI－1640洗涤两遍。
5． 细胞计数，用RPMI－1640调整细胞浓度为0.5-1×105 ／ml，置于六孔培养板中，每孔2ml。
6． 37℃，5％CO2，饱和湿度下贴壁2－3h
7． 吸弃上清，用37℃预温的RPMI－1640轻轻洗去非贴壁的细胞，每孔加入2ml的完全培养液继续培养。
8． 隔日半定量换液，小心弃去悬浮细胞，轻轻转动培养板，防止细胞凝集。第七天收集悬浮细胞，做相关的实验。
按照如此方法培养的细胞效果相当好。一般流式检测可以达到80％的纯度。

8、怎样高效率转染DC（DC2.4）细胞？

高效率传染他的细胞的时候就是给他抗体的刺激，在抗体抗原的刺激下她才可以。

9、科学家研究发现一种树突状细胞（DC细胞，在免疫反应中有强大的摄取、处理和传递抗原的功能）．图示DC细胞

（1）吞噬细胞和DC通过胞吞的方式对抗原进行吞噬处理，免疫系统也对自身的病变、衰老的细胞清除，体现了免疫系统的防卫、监控和清除功能．
（2）T细胞能识别抗原表面的抗原决定簇，这个过程称细胞间的信息交流，是细胞膜的功能之一．
（3）T细胞在体液免疫中合成释放的淋巴因子作用于B细胞使B细胞增殖分化为浆细胞和记忆细胞，T细胞也可以增殖分化为效应T细胞和记忆细胞，能参与细胞免疫．
（4）活化巨噬细胞对细菌X的杀伤力最强．因假设是活化T细胞释放了某种物质活化了巨噬细胞，故实验组选择的材料应是培养过活化T细胞的培养液，用其培养由体内没有活化T细胞的B组小鼠分离出来的巨噬细胞，观察其对细菌X的杀伤力．
（5）第二次两人均注射等量α-银环蛇毒疫苗后血液中α-银环蛇毒的抗体含量为变化为：甲由于间隔时间长，记忆细胞基本消失，不能发生二次免疫反应，产生的抗体较少且慢；乙注射疫苗时间短，记忆细胞较多，可以发生二次免疫，产生的抗体快而且多，曲线图见答案．
故答案为：
（1）胞吞（1分）   防卫、监控和清除
（2）识别（1分）     信息交流（1分）
（3）淋巴因子（1分）      B（1分）      效应T细胞
（4）活化的巨噬细胞   a、d、f
（5）