1、T淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合后可制备杂交瘤细胞 为什么不对
是B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合后可制备杂交瘤细胞。
B淋巴细胞具有产生单一抗体的能力，但不能在体外增殖；骨髓瘤细胞是一种癌细胞，它能在体外培养条件下无限增殖，但不能产生抗体。因此，把一种B淋巴细胞与骨髓瘤细胞进行细胞融合，产生杂交瘤细胞，它会兼有两个亲本细胞的特性──在体外培养条件下能不断增殖，同时能产生出某种特异性的抗体。
T淋巴细胞来源于骨髓的多能干细胞，T淋巴细胞不产生抗体，而是直接起作用。所以T淋巴细胞的免疫作用叫作“细胞免疫”
2、关于T细胞和瘤细胞的问题
任何一种病原微生物都具有多种抗原决定簇，因
此，在机体内诱发出来的抗体也必然是多种抗体的混
合物，称为多克隆抗体, 这种抗体制剂在医疗中常常 发生非特异性交叉反应而出现假阳性结果。 根据Burnet的“克隆选择”学说，每个淋巴B细胞 克隆只能产生一种能识别特异性抗原决定簇的抗体， 这就是单克隆抗体 (monoclonal antibody, McAb)。
单克隆抗体是将抗体产生细胞与具有无限 增殖能力的骨髓瘤细胞相融合，通过有限稀释 法及克隆化使杂交瘤细胞成为纯一的单克隆细 胞系而产生的。
制备特定抗原的单克隆抗体，首先要制备用于免 疫的适当抗原，再用抗原进行动物免疫。
有的抗原可以用化学合成：地高辛
多数抗原物为混合物须经免疫、筛选、克隆化。
1975年，英国剑桥大学的 Kohler and Milstein 成功采用细胞融合技术， 使小鼠的脾细胞与小鼠的骨髓瘤细胞融合，形成杂交瘤细胞 (hybridoma cells)，利用骨髓瘤细胞无限增殖能力，定向产生只作用于某一抗原决定 簇的McAb，这就是著名的杂交瘤技术(hybridoma technique)，被称为免疫 学的一场革命。
对小鼠免疫，刺激抗体产生
从脾中分离产生抗 体的细胞
组织培养的骨髓瘤细胞
产抗体的细胞与培养的肿瘤细胞融合，形成杂交瘤细胞
杂交瘤细胞的筛选 克隆产抗体的杂交瘤细胞 分离单克隆抗体
第二节 单克隆抗体及其制备
一、抗原于动物免疫①
用抗原或免疫原对动物 (小鼠)进行免疫， 得到经抗原刺激产生的淋巴B细胞，用以同 骨髓瘤细胞杂交，是单克隆抗体制备的第 一步。 目前培养的骨髓瘤细胞株系多来自小鼠 或大鼠，选择的免疫动物也必须是那些与 小鼠或大鼠种系发生相近的动物，这样才 会克服杂交瘤细胞的不稳定性。
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第二节 单克隆抗体及其制备
一、抗原于动物免疫②
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体内免疫法 选择18-20周龄的雌鼠；选择抗原量较多、 且抗原的免疫原性强的免疫原。
① 颗粒性抗原 (细菌、细胞) 107个细胞，向小鼠腹部注射； 间隔1-3周，追加免疫1-2次。 ② 可溶性抗原10-100 ?g/只，加弗氏完全佐剂*，注射，间 隔2-4周，追加不加佐剂的抗原1-2次。 ③ 采集细胞前最后一次静脉注射抗原。
*弗氏完全佐剂 Freund’s Complete Adjuvant：在乳化油中悬浮被杀死的、干制 的分枝杆菌-人结核杆菌或“卡介苗” (Mycobacterium butyricum)细胞。与 抗原混合注射到动物皮下，抗原会缓慢而均匀地被释放出来，诱发动物免 疫系统高效而均一地产生抗体。
第二节 单克隆抗体及其制备
一、抗原于动物免疫③
?
体外免疫法 没有体内免疫条件，或抗原的免疫原性弱时采用。
① 选择4-8周龄的小鼠脾脏，用200目不锈钢网膜制成细胞 悬浮液；
② 加入抗原，使抗原在细胞悬浮液中的浓度控制在0.55.0 ?g/ml； ③ 37℃、5% CO2下培养4-5天，分离脾细胞。
第二节 单克隆抗体及其制备
二、细胞融合于杂交瘤的选择 ①
细胞融合
脾细胞 (1×108)
聚乙二醇 (PEG)
40-50%、Mr=4000
骨髓瘤细胞 (2-3×107)
为了增加融合率，可以在PEG 溶液中加入二甲基亚砜 (DMSO)
融合2分钟 用缓冲液缓慢稀释
注意：PEG和DMSO对细胞有毒，必须 严格控制二者同细胞的接触时间。可以 在融合前对混合细胞低速离心5分钟， 先使细胞之间接触紧密。
第二节 单克隆抗体及其制备
二、细胞融合于杂交瘤的选择 ②
杂交瘤细胞的筛选
融合处理后，混合溶液中可以产生5种细胞： 脾-脾、瘤-瘤、脾-瘤三种融合细胞， 脾、瘤两种非融合细胞。
必须使用“HAT选择”才能把其中的脾-瘤融合细 胞 (杂交瘤细胞)筛选出来。
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什么是“HAT选择”？
HAT选择的基本原理与杂交瘤的筛选
HAT培养基因其中含有三种化合物而命名： Hypoxanthine Aminopterin Thymidine 次黄嘌呤： H 氨基喋呤： A 胸腺嘧啶核苷： T
H
HGPRT
HAT培养基用于排除两种基因型细胞： ① hgprt－：缺乏次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖 转移酶的细胞不能生长 (骨髓瘤细胞) ② tk－：缺乏胸苷激酶的细胞不能生长 (两 种细胞都不缺乏这个酶，没有选择效应) 小鼠骨髓瘤细胞与小鼠脾细胞融合的HAT选择
前体分子
dGTP
A
在细胞融合程序中产生五种细胞：
dTTP
T
TK
骨髓瘤细胞： hgprt－，不能生长； 脾细胞： 体外HAT培养不能生长； 脾-脾融合细胞：体外HAT培养不能生长；
细胞中DNA合成所需的脱氧核苷酸 的合成路线及HAT选择原理
HGPRT 次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶 hypoxanthineguanine phosphoribosyl transferase
瘤-瘤融合细胞：hgprt－，不能生长；
脾-瘤融合细胞：因脾细胞为hgprt＋，可生长；
TK 胸腺嘧啶核苷激酶(胸苷激酶) thymidine kinase
第二节 单克隆抗体及其制备
二、细胞融合于杂交瘤的选择 ③
?将融合后的混合细胞悬浮于HAT培养基中(附加饲养
细胞—小鼠腹腔巨噬细胞、脾细胞或胸腺细胞，这 些细胞释放的细胞因子有利于杂交瘤细胞的繁殖)， 置96孔板内培养6天(每隔2-3天换培养基1/2—2/3)；
?改用HT培养基（即不加氨基喋呤的HAT）培养8天；
?再改用RPMI1640完全培养基继续培养。
*融合后培养的第8-9天就可以对培养液的上清部分 进行抗体检测，逐步选出阳性克隆。
第二节 单克隆抗体及其制备
三、筛选阳性克隆与克隆化 ①
筛选：经过免疫，动物脾细胞中只有5%能够产生
抗体，只有这些细胞与骨髓瘤细胞融合后才 能产生杂交瘤细胞。
融合后的第8-9天，就必须对能够产生 抗体的杂交瘤细胞进行筛选。一般采用酶联 免疫吸附检验法 (enzyme –linked immunosorbent assay, ELISA)。 （P148 图4-3）
第二节 单克隆抗体及其制备
三、筛选阳性克隆与克隆化 ②
克隆：尽早克隆阳性细胞，利于杂交瘤细胞克服不稳定性。
有限稀释法：把阳性克隆悬浮液稀释到每个培养孔内只 有1个细胞；
软琼脂法：用5%的琼脂糖使培养基呈半固体状态，一 个细胞的克隆后代将形成一个细胞团块。但克隆过 程至少要重复3次，才能保证得到100%的阳性克隆。
? 经过这些步骤，得到的每一个克隆就是单细胞克隆。
第二节 单克隆抗体及其制备
四、杂交瘤细胞抗体形状的鉴定 ① 细胞学鉴定
染色体核型 chromosome karyotype
人的有丝分裂中期染色体显微图象及核型分析
(外周血白细胞培养染色体涂片)
第二节 单克隆抗体及其制备
四、杂交瘤细胞抗体形状的鉴定 ① 细胞学鉴定 ? 动物的染色体制片技术相对简单，在普通光学显微 镜下就可以确定染色体核型(chromosome karyotype) 。 ? 小鼠的染色体全部都是端部着丝点染色体，2n=40； 骨髓瘤细胞染色体数目大于40，2n＞40，并且有骨 髓瘤特有的标记染色体。所以，杂交瘤细胞的染色 体数目应该是两种细胞染色体数之和。
? 由于有HAT选择在前，用核型分析确定杂交瘤细胞 只有一个条件：2n≥80。
第二节 单克隆抗体及其制备
四、杂交瘤细胞抗体形状的鉴定 ② 抗体性状的鉴定
小鼠脾的淋巴B细胞是多克隆的，每个杂交 瘤细胞系产生的抗体都是由抗原的一个决定簇 诱发的单克隆抗体。必须对这些单克隆的淋巴 B细胞各自产生的抗体做免疫性状的鉴定。
杂交瘤细胞所分泌的抗体的生 物学特性的鉴定，要按照单克隆 抗体制备要求，进行各种指标的 鉴定。
第二节 单克隆抗体及其制备
五、单克隆抗体的大量制备 ① 动物体内诱生法： 选用杂交瘤亲本动物，腹腔注射有机溶剂降 植烷 (姥鲛烷 pristane) 0.5 ml，1-2周后注射杂交瘤 细胞1×106个，7-12天后分几次抽取生成的腹水， 离心取上清，冻存。
这个方法一般可获得抗体5-20 mg/ml，操作简 单经济。但由于腹水中有多种杂蛋白，给纯化带 来困难。
第二节 单克隆抗体及其制备
五、单克隆抗体的大量制备 ②
体外培养法：
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用RPMI1640培养基，添加10-20%的胎牛或小牛血 清 (BSA)，直接体外培养杂交瘤细胞； 抗体产率达到5-20 ?g/ml； 如果用白蛋白、胰岛素、转铁蛋白、乙醇胺等混 合物代替小牛血清，可以减少支原体的感染，但 产率不高。
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第二节 单克隆抗体及其制备
五、单克隆抗体的大量制备 ③
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连续悬浮培养技术 微载体悬浮培养法，培养基添加DEAESephadex A50 (二乙基氨基乙基-葡聚糖)固体颗粒， “锚定” (anchoring) 杂交瘤细胞，利于旺盛生长；
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细胞密度可达到107-108/ml，抗体产率可提高到 400-4000 ?g/ml。
第二节 单克隆抗体及其制备
六、单克隆抗体的纯化 ①
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动物体内诱生法制备的单克隆抗体的纯化
⑴ 澄清和沉淀处理：
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1,000×g 离心 5 min后取上清，除去红细胞、细胞碎块、 纤维蛋白凝块、脂质；再用20,000 ×g 离心 30 min，取 上清去除残留的小颗粒物质； 用 0.2 ?m微孔滤膜过滤：去除污染的细菌、支原体和脂 质； 用50%饱和(HN4)2SO4沉淀，可回收90%以上的单克隆抗 体。
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第二节 单克隆抗体及其制备
六、单克隆抗体的纯化 ②
⑵ 分离：凝胶过滤、阴离子交换层析、免疫亲和层析
① 凝胶过滤：用Sephadex G200过柱分离，最 高峰为IgM类单克隆抗体，另两个峰值为IgG类。
样品自动被传输到样品瓶中， 然后被提取到定量环中，进入GPC 柱进行分析。高分子量的部分被洗 脱到废液瓶中，其他待分析物被收 集到样品瓶中，以便进一步分析 (或者进行在线蒸发)。
AS-2000凝胶过滤系统
第二节 单克隆抗体及其制备
六、单克隆抗体的纯化 ③
② 阴离子交换层析： ? 杂交瘤上清液: 澄清沉淀(调pH 5.5) ? 过EDAE-G (二乙基氨基乙基纤维素)柱，所有的 抗体都结合到柱上，同时除去了55%的杂蛋白。
? 用不同的pH值和不同离子强度的洗脱液洗脱不 同亚基的单克隆抗体。 ? 高容量、高流速、化学稳定的新型离子交换剂 适宜单克隆抗体的大规模纯化。
第二节 单克隆抗体及其制备
六、单克隆抗体的纯化 ④ ③ 免疫亲和层析：用固定化的A蛋白 (从金黄色葡萄球菌中 分离) ? 1 ml protein A-Sepharose CL-4B柱； ? 平衡缓冲液：1.5 mol/L Gly-NaOH (pH 8.9)，内含3 ml/L NaCl； ? 洗脱缓冲液：0.1 mol/L 柠檬酸(调不同pH值) pH 6.0 / IgG1 pH 4.5 / IgG2a pH 4.0 / IgG3 pH 3.5 / IgG2b pH 3.0 洗涤
3、t细胞有几种？分别发挥什么作用？
其实严格意义上：T细胞是T淋巴细胞的简称。。。而T细胞可以增值分化为效应T细胞。。。
但是在一些实验中可能会淡化他们的区别，把T细胞作为效应T细胞的代称（不知道有没有这个实验，但是B细胞就是。。。如制备单克隆抗体的时候，用的是B细胞和骨髓瘤细胞融合（实际应该是效应B细胞，问过老师，她说按书本的来，我们知道是效应B细胞就行了，不知道现在书本有没有改过来））
至于作用：新版教材纠正了（我是2011届毕业生），T淋巴细胞没有呈递抗原的作用，只是释放淋巴因子，增强免疫杀伤力。效应T细胞：主要是裂解靶细胞（它好像也可以分泌淋巴因子等免疫活性物质，记得不是很清楚了）
纠正楼上的：没有“效应T淋巴细胞”的说法
4、效应T细胞与骨髓瘤细胞合成单克隆抗体么？
一种效应B细胞只能分泌一种抗体，所以可以用效应B细胞与骨髓瘤细胞融合成杂交瘤细胞，选择可以产生抗体的杂交瘤细胞就可以制造单克隆抗体。
它们不是在一起进行的，所以不能杀死。
再看看别人怎么说的。
5、请教一下，在做杂交瘤融合时，脾细胞中的T细胞之类的会与骨髓瘤细胞融合形成杂交瘤吗？
杂交瘤细胞是浆细胞和骨髓瘤细胞融合，融合后的杂交瘤细胞才能即能产生抗体又能无限增殖。
6、什么是骨髓瘤
是一种恶性浆细胞病，其肿瘤细胞起源于骨髓中的浆细胞，而浆细胞是B淋巴细胞发育到最终功能阶段的细胞。这种一般很难好，一般都是早期干预效果比较好，rh2，注射促红细胞生成素这些在早期都比较好。
7、骨髓瘤是怎么回事？
骨髓瘤属于一种进行性的肿瘤疾病，很有可能是由于肿瘤细胞起源于骨髓中的浆细胞，很有可能会出现身体贫血，可能还会导致心慌心闷，引起面色苍白，四肢乏力等情况，如果治疗不及时，还会导致红细胞白红蛋白的下降，一定要尽早的治疗，防止病情加重。