小鼠骨髓来源树突状细胞

1、求助：树突状细胞（DC）与T细胞的MLRs

我看到园子里很多战友求助关于树突状细胞的培养问题，倾情奉上我培养的方法，对新手朋友也许有所帮助：
1. C57Bl/6小鼠
2. 处死小鼠，75%酒精浸泡10min
3.解剖取出小鼠股骨和胫骨
4.去除骨上组织
5.冲洗骨髓腔，直至骨变白
6.收集的细胞沉淀以10000/ml细胞数接种，培养液含200U/mlrmGM-CSF和IL-4

2、小鼠骨髓来源树突状细胞增殖的是什么细胞

您好，现在这个行业发展的不错，生物实验技术外包也会跟着发展，比如一些高校或者企业部分实验不想自己内部开展，或者涉及的设备比较昂贵，技术要求高，都会寻求外包。但是现在竞争也比较大，的得看单位这边整体做的怎么样。

其次要看下你选择单位的规模如何，上海这边的，你可以看下基尔顿生物。

3、怎样高效率转染DC（DC2.4）细胞？

高效率传染他的细胞的时候就是给他抗体的刺激，在抗体抗原的刺激下她才可以。

4、请教树突状细胞的培养经验

树突状细胞的培养，目前还没有传代的细胞柱，大家一般采取的是两种办法，一种是从组织分离，主要应用的是细胞磁珠经过纯化，然后配取合适的培养基进行诱导培养。
另一个就是单纯的联合诱导培养，我就是采用这个方法。具体的protocal如下：C57BL/6小鼠，6～8周龄，雌性，体重18～20g，购自北京军事医学科学院动物中心。细胞因子rmGM-CSF及rmIL-4为美国Peprotech公司产品。CD11C+细胞磁珠分离纯化试剂盒为德国Milentyi公司产品。
1． 采用断头术处死小鼠，在75％的酒精中浸泡2－3min后，置于无菌平皿中，剪开皮肤。取出双侧股骨，用无菌的生理盐水（或RPMI－1640代替）刷洗2－3次后剪开骨两端，用1ml的注射器抽取RPMI－1640液，将骨髓细胞冲入15ml离心管中。
2． 将骨髓细胞轻轻吹打，使细胞完全悬浮，静置五分钟，然后转入另一个15ml离心管中，离心，1200rpm，10min 。
3． 弃上清，细胞沉淀按1：10加入Tris-NH4CL缓冲液，轻轻吹打混匀，室温放置五分钟。
4． 离心后，弃上清，细胞沉淀用RPMI－1640洗涤两遍。
5． 细胞计数，用RPMI－1640调整细胞浓度为0.5-1×105 ／ml，置于六孔培养板中，每孔2ml。
6． 37℃，5％CO2，饱和湿度下贴壁2－3h
7． 吸弃上清，用37℃预温的RPMI－1640轻轻洗去非贴壁的细胞，每孔加入2ml的完全培养液继续培养。
8． 隔日半定量换液，小心弃去悬浮细胞，轻轻转动培养板，防止细胞凝集。第七天收集悬浮细胞，做相关的实验。
按照如此方法培养的细胞效果相当好。一般流式检测可以达到80％的纯度。

5、天然免疫如何通过树突状细胞调节获得性免疫

Toll样受体(Toll-like receptors，TLRs)作为一类重要的模式识别受体(Patternrecognition receptors，PRRs)主要表达于巨噬细胞和树突状细胞(Dendritic cells，DCs)表面，选择性地识别病原体相关分子模式(Pathogen-associated molecularpatterns，PAMPs)，构成机体免疫系统抵御病原体入侵的第一道屏障。TLR是一类在各种生物体内高度保守的Ⅰ型跨膜蛋白，目前已在哺乳动物中发现并克隆了12种。一旦识别了病原体中特定的分子结构，TLR就会激活其下游一系列的信号通路，活化天然免疫细胞产生炎性细胞因子和Ⅰ型干扰素。TLR不仅启动天然免疫应答，控制炎症反应的性质、强度和持续时间，还可以通过上调DC表面的MHCⅡ类分子和共刺激分子，促进DC的成熟，指导抗原特异的免疫应答尤其是Th1型反应的产生，调节获得性免疫应答的强度和类型，成为连接初始免疫应答和获得性免疫应答的桥梁。TLR信号过度活化或活化不足会导致机体功能异常和疾病的发生。许多的其他信号通路参与对TLR信号的严密调控。因此，对TLR信号转导调控的深入研究具有重要的理论意义和应用价值。 Ca2+作为细胞内第二信使之一，调节很多重要的生理过程。钙/钙调素依赖性蛋白激酶Ⅱ(Calcium/calmolin-dependent protein kinaseⅡ，CaMKII)是钙信号下游的一种多功能丝/苏氨酸蛋白激酶，广泛分布于机体大部分重要器官组织中。它由四个独立的基因α、β、γ及δ编码，且存在着不同的剪切体，因而产生多达24种不同的同型物。CaMKII有着众多的作用底物，如转录因子CREB、ATF及其他信号分子p56Ick、SHP-2、STAT1等。CaMKII可调节机体的多种重要生理功能，如突触的信号传递、记忆、物质的代谢、肌肉的收缩、基因的表达及细胞周期的调控。近年来研究表明CaMKII在免疫系统中发挥重要的调控功能，如T细胞的活化和记忆，DC的成熟和抗原提呈。 LPS(TLR4配体)被证明可以促发小鼠巨噬细胞胞浆中的钙流，其对LPS诱导的TNF-α的产生有重要的作用，也有研究显示CaMKII可增强血小板激活因子(PAF)预刺激的THP-1细胞中LPS诱导的TNF-α的产生。这些研究提示Ca2+和CaMKII可能参与了TLR4信号。然而，钙和CaMKII在TLR配体诱导的炎性细胞因子和Ⅰ型干扰素产生中的作用，以及Ca2+/CaMKII信号通路与TLR信号通路的交互作用及其相关机制目前尚不清楚(问题1)。 MicroRNAs(miRNAs)是一类众多的内源性非编码小RNA，参与很多的生理病理过程。miRNAs在免疫系统功能调节中发挥重要的作用，包括调控巨噬细胞的对外来病原体的初始免疫应答，淋巴细胞的发育、分化和功能等等。然而，关于具有调控DC成熟和功能的作用的miRNA却很少报道。既然CaMKII被证明在DC的成熟和功能中发挥重要的作用，且目前有关miRNA与CaMKII的研究尚未见报道，因此，我们想探索是否存在以及哪些miRNAs能通过直接作用于CaMKII，从而在DC的成熟、活化以及刺激T细胞的增殖方面发挥调节作用(问题2)。 以前的研究表明抗原刺激能诱导DC胞浆中钙流的上升，而钙和CaMKII均能调控DC的MHCⅡ类分子的表达，表明Ca2+/CaMKII与MHCⅡ类分子之间存在着相互调控。然而MHCⅡ分子被抗原之外的其他分子交联后能否诱导CaMKII的活化尚不清楚(问题3)。 MHCⅡ类分子主要表达于DC、单核巨噬细胞及B淋巴细胞等专职抗原提呈细胞上，而这些细胞正是外来病原体成分等危险信号的主要感应细胞。一些研究表明MHCⅡ类分子可介导逆向信号，影响和调节免疫细胞的很多生理过程。基于此，MHCⅡ类分子是否能感应危险信号或者对危险信号激发的免疫反应起调控作用，目前尚不清楚(问题4)。 我们对上述四个方面的科学问题及其可能的内在联系进行了系统性的研究，分别从四个方面探讨了CaMKII、靶向CaMKII的miRNA和MHCⅡ类分子这三类分子的相互作用和对TLR触发的巨噬细胞与树突状细胞天然免疫应答反应的调控及其机制。 一、钙/钙调素依赖性蛋白激酶Ⅱ对TLR触发的巨噬细胞天然免疫应答反应的调控及其机制研究 在硕士论文的研究中，我们已经发现LPS、CpG ODN和poly(I：C)(分别为TLR4、TLR9和TLR3配体)能够显著地诱导CaMKlI的活化，表现为CaMKII(T286)磷酸化的增加和激酶活性的上升，同时利用CaMKII的特异抑制剂KN62抑制CaMKII的活性能显著降低TLR4、9、3配体诱导的炎性细胞因子IL-6和TNF-α以及IFN-β的产生，其下游信号机制是通过抑制MAPK、NF-κB和IRF3来介导。 综上所述，TLR配体能诱导巨噬细胞胞内钙的释放以及CaMKII的活化，活化的CaMKII通过直接结合、磷酸化并活化TLR信号中重要的信号分子TAK1和IRF3，增强下游信号通路的活化，从而加强TLR配体诱导的炎性细胞因子IL-6、TNF-α和Ⅰ型干扰素的产生，表明Ca2+/CaMKII信号通路与TLR信号通路之间的交互作用是巨噬细胞充分活化所必需的。本部分研究发现了CaMKII的新的免疫调控功能及其所作用的靶分子，另外也丰富了TLR信号转导调控的研究内容，有助于进一步深入认识机体在抵御外来病原体时的免疫应答反应及其精细调控机制。 二、靶向CaMKII的miR-148/152对树突状细胞成熟和功能的影响 DC的成熟与活化是初始免疫应答和获得性免疫应答的重要基础，多种调节因子参与维持DC的稳态。以前的研究表明CaMKII也是DC成熟和功能发挥的一重要调节分子，抑制CaMKII的活化可下调DC表面MHCⅡ类分子的表达、IL-12和IFN-γ的分泌以及CD4+T细胞的增殖。我们前一部分的研究表明CaMKII可以加强TLR配体诱导的巨噬细胞炎性细胞因子IL-6、TNF-α和Ⅰ型干扰素的产生。既然DC也表达CaMKII，那么DC中的TLR信号也应该受到CaMKII的正向调控。 综上所述，miR-148/152通过作用于靶分子CaMKII-α，从而负向调控TLR配体触发的DC初始免疫应答和抗原提呈功能。miR-148/152为一新的DC成熟和功能的负向调节因子，为免疫应答反应的调控提供了另一种新的方式。 三、Ca2+/CaMKII与MHCⅡ类分子之间的相互调控 以前的研究表明抗原刺激能诱导DC胞浆中钙流的上升，而上调的钙信号是DC成熟和功能发挥所需的一种重要因素。CaMKII能调节DC的MHCⅡ类分子的表达，抑制CaMKII的活化不但能增加MHCⅡ类分子的溶酶体转运和降解，还能抑制MHCⅡ mRNA的转录及稳定性。然而，除了抗原之外其他分子交联MHCⅡ类分子后引起的胞浆钙流及CaMKII的活化尚不很清楚。我们发现，利用siRNA降低DC中CaMKII的表达可显著抑制LPS诱导的DC表面MHCⅡ类分子的上调表达，而用抗体交联DC表面的MHCⅡ类分子能增强LPS未诱导的和诱导的CaMKII的活化。 四、MHCⅡ类分子逆向信号促进TLR触发巨噬细胞与树突状细胞的天然免疫应答反应及其机制研究 目前对于MHCⅡ类分子的非经典功能的研究比较少。既然MHCⅡ类分子与TLR均主要表达于专职抗原提呈细胞上，我们设想MHCⅡ类分子能否感应或辅助感应危险信号，或者对危险信号激发的免疫反应具有调控作用昵?利用基因敲除小鼠及RNA干扰技术，我们对这一问题进行了研究。与野生型小鼠(MHCⅡ+/+相比，MHCⅡ缺陷(MHCⅡ-/-)小鼠腹腔巨噬细胞和骨髓来源的DC在LPS、CpG ODN和poly(I：C)刺激后，产生的IL-6、TNF-α、IL-12和IFN-β显著降低。在巨噬细胞和DC中干扰MHCⅡ类分子的表达后，也明显降低了TLR配体诱导的上述细胞因子的分泌。 总之，我们四部分的内容研究了CaMKII、靶向CaMKIIα的miR-148/152以及MHCⅡ类分子的相互作用及其对TLR信号转导的调控及相关的机制，证明了CaMKII和MHCⅡ类分子是抗原提呈细胞-巨噬细胞和DC中TLR信号充分活化所必需的，同时发现了新的可以调控DC成熟和功能的miRNA(miR-148/152)，揭示了CaMKII和MHCⅡ这两种重要的分子可以在两种主要的抗原提呈细胞-巨噬细胞和DC中相互调控，从而共同参与维持免疫系统的平衡和稳定。该研究结果拓宽了人们对于MHCⅡ类分子的性质与功能的认识，丰富了TLR免疫识别及其调控机制的研究内容，也有望为免疫相关疾病发病机制的研究与治疗方法的寻找提供新的启示。

6、什么品牌转染试剂可以转染BMDM细胞（小鼠骨髓来源巨噬细胞）？转染效率高啊？

BMDM小鼠骨髓来源巨噬原代细胞转染siRNA或者质粒DNA的难度都是很大的，2020年1月西南医科大学中西医结合医院使用美国Zeta Life公司Advanced Transfection Reagent转染试剂，货号AD600150，成功转染BMDM细胞小鼠骨髓来源的巨噬细胞已发表文章，文章标题(A&P)compound
relievedcisplatin-

具体转染条件等可以咨询作者，希望对大家的细胞转染带来帮助。

7、小鼠骨髓来源树突状细胞 用多大的小鼠

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8、小鼠骨髓来源树突状细胞 体外培养 为什么过度成熟

小鼠骨髓来源调节性树突状细胞的体外培养和鉴定
这个是有百度文献的，根据文件来做哈，应该还是不错的

9、哪个品牌转染试剂可以转染BMDMs细胞(小鼠骨髓来源的巨噬细胞）？

已经发表文章转染BMDMs细胞(小鼠骨髓来源的巨噬细胞文章如下：

清华大学免疫学研究所发表文章

清华大学用invigentech产品

清华大学

清华大学免疫学研究所