人骨髓瘤细胞rpmi8226培养基

1、淋巴细胞分离RPMI1640就是通常说的1640培养基么

，这两个是相同的
RPMI的的罗斯威尔公园纪念研究所的缩写，代表的是罗四维公园纪念研究所。的RPMI细胞培养基中的研究和发展研究所1640培养基守则。含有10％胎牛血清。

2、骨髓瘤 培养

杂交瘤技术在具体操作上，各实验室使用的程序不尽一致。本节中介绍的方法是作者所在实验室采用的、实践证明成熟的程序，该程序适合国内大多数实验室。

在开展杂交瘤技术制备单抗之前，培养骨髓瘤和杂交瘤细胞必须具备下列主要仪器设备：超净工作台、CO2恒温培养箱、超低温冰箱（-70℃）、倒置显微镜、精密天平或电子天平、液氮罐、离心机（水平转子，4000r/min）、37℃水浴箱、纯水装置、滤器、真空泵等。其需要的主要器械包括：100ml、50ml、25ml细胞培养瓶，10ml、1ml刻度吸管，试管，滴管（弯头、直头），平皿，烧杯，500ml、250ml、100ml盐水瓶，青霉素小瓶，10ml、5ml、1ml注射器等，96孔、24孔细胞培养板，融合管（50ml圆底带盖玻璃或塑料离心管），眼科剪刀，眼科镊，血细胞计数板，可调微量加样器（~50ul，~200ul，~1000ul），弯头针头，200目筛网，小鼠固定装置等。此外，杂交瘤细胞的筛选与检测的仪器设备，依据检测单抗的方法不同而各异，请参阅本节有关部分。

淋巴细胞杂交瘤技术的主要步骤包括：动物免疫、细胞融合、杂交瘤细胞的筛选与单抗检测、杂交瘤细胞的克隆化、冻存、单抗的鉴定等，图6-1概括了淋巴细胞杂交瘤技术研制单抗的主要过程。

1、动物免疫

(1) 抗原制备制备单克隆抗体的免疫抗原，从纯度上说虽不要求很高，但高纯度的抗原使得到所需单抗的机会增加，同时可以减轻筛选的工作量。因此，免疫抗原是越纯越好，应根据所研究的抗原和实验室的条件来决定。一般来说，抗原的来源有限，或性质不稳定，提纯时易变性，或其免疫原性很强，或所需单抗是用于抗原不同组分的纯化或分析等，免疫用的抗原只需初步提纯甚至不提纯，但抗原中混杂物很多，特别是如果这些混杂物的免疫原性较强时，则必须对抗原进行纯化。检测用抗原可以是与免疫抗原纯度相同，也可是不同的纯度，这主要决定于所用筛检方法的种类及其特异性和敏感性。

(2) 免疫动物的选择根据所用的骨髓瘤细胞可选用小鼠和大鼠作为免疫动物。因为，所有的供杂交瘤技术用的小鼠骨髓瘤细胞系均来源于BALB/c小鼠，所有的大鼠骨髓瘤细胞都来源于LOU/c大鼠，所以一般的杂交瘤生产都是用这两种纯系动物作为免疫动物。但是，有时为了特殊目的而需进行种间杂交，则可免疫其他动物。种间杂交瘤一般分泌抗体的能力不稳定，因为染色体容易丢失。就小鼠而言，初次免疫时以8-12周龄为宜，雌性鼠较便于操作。

(3) 免疫程序的确定免疫是单抗制备过程中的重要环节之一，其目的在于使B淋巴细胞在特异抗原刺激下分化、增殖，以利于细胞融合形成杂交细胞，并增加获得分泌特异性抗体的杂交瘤的机会。因此在设计免疫程序时，应考虑到抗原的性质和纯度、抗原量、免疫途径、免疫次数与间隔时间、佐剂的应用及动物对该抗原的应答能力等。没有一个免疫程序能适用于各种抗原。现用的免疫程序中多数是参照制备常规多克隆抗体的方法。表6-1列举了目前常用的免疫程序。免疫途径常用体内免疫法包括皮下注射、腹腔或静脉注射，也采用足垫、皮内、滴鼻或点眼。最后一次加强免疫多采用腹腔或静脉注射，目前尤其推崇后者，因为可使抗原对脾细胞作用更迅速而充分。在最后一次加强免疫后第3天取脾融合为好，许多实验室的结果表明，初次免疫和再次免疫应答反应中，取脾细胞与骨髓瘤细胞

融合，特异性杂交瘤的形成高峰分别为第4天和第22天，在初次免疫应答时获得的杂交瘤主要分泌IgM抗体，再次免疫应答时获得的杂交瘤主要分泌IgG抗体。笔者体会阳性杂交瘤出现的高峰与小鼠血清抗体的滴度并无明显的平行关系，且多在血清抗体高峰之前。因此，为达到最高的杂交瘤形成率需要有尽可能多的浆母细胞，这在最后一次加强免疫后第3天取脾进行融合较适宜。已有人报道采用脾内免疫，可提高小鼠对抗原的免疫反应性，且节省时间，一般免疫3天后即可融合。

表6-1 不同免疫抗原的免疫程序

免疫原特性 抗原量 接种次数 间隔时间 单抗的特性 抗体滴度 亲和性

免疫原性强（如细胞、细菌和病毒等） 106-107个细胞或1-10ug 2-4 2-4周 高 中等至强

免疫原性中等 10-100ug 2-4 2-4周 中等或高中等或强

免疫原性弱 A.20-400ug 2-4 随后 2-3 每月 2-3月中等 强

B.10-50ug 其后 200-400ug 2 其后 4 每月 每天 中等 中等

C.10-100ug 2 其后 4 其后“休息” 最后加强 每月 10天 1-2月

中等 中等或强

体内免疫法适用于免疫原性强、来源充分的抗原，对于免疫原性很弱或对机体有害（如引起免疫抑制）的抗原就不适用了。如果制备人单克隆抗体几乎不大可能采用体内免疫法。因此，针对这些情况，可采用体外免疫。所谓体外免疫就是将脾细胞（或淋巴结细胞，或外周血淋巴细胞）取出体外，在一定条件下与抗原共同培养，然后再与骨髓瘤细胞进行融合。其基本方法是取4-8周龄BALB/c小鼠的脾脏，制成单细胞悬液，用无血清培养液洗涤2-3次，然后悬浮于含10%小牛血清的培养液中，再加入适量抗原（可溶性抗原0.5-5ug/ml，细胞抗原105-106个细胞/ml）和一定量的BALB/c小鼠胸腺细胞培养上清液；在37℃，6%CO2浓度下培养3-5天，再分离脾细胞与骨髓瘤细胞融合。

2、细胞融合

（1） 主要试剂的配制

a、 细胞培养基杂交瘤技术中使用的细胞培养基主要有RPMI-1640或DMEM（Dulberco Modified Eagles Medium）两种基础培养基，具体配制方法按厂家规定的程序，配好后过滤除菌（0.22um），分装，4℃保存。

"不完全RPMI-1640培养基：RPMI-1640培养基原液96ml

100×L.G.溶液1ml

双抗溶液1ml

7.5% NaHCO3溶液1-2ml

HEPES溶液1ml

"不完全DMEM培养基：DMEM 13.37g

超纯水或四蒸水980ml

NaHCO3 3.7g

双抗溶液10ml

100×L.G.溶液10ml

用1N HCl调试PH至7.2-7.4，过滤除菌，分装4℃保存。

"完全RPMI-1640或DMEM培养基：不完全RPMI-1640或DMEM培养基80ml

小牛血清15-20ml

用于骨髓瘤细胞SP2/0和建株后的杂交瘤细胞培养。

"HT培养基：完全RPMI-1640或DMEM培养基99ml

HT贮存液1ml

"HAT培养基：完全RPMI-1640或DMEM培养基98ml

HT贮存液1ml

A贮存液1ml

b、 氨基喋呤（A）贮存液（100×，4×10-5mol/L） : 称取1.76mg氨基喋呤（Aminopterin MW 440.4），溶于90ml超纯水或四蒸水中，滴加1mol/L NaOH 0.5ml中和，再补加超纯水或四蒸水至100ml。过滤除菌，分装小瓶（2ml/瓶），-20℃保存。

c、次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷（HT）贮存液(100×,H:10-2mol/L，T：1.6×10-3mol/L): 称取136.1mg次黄嘌呤(Hypoxanthine,MW 136.1)和38.8mg胸腺嘧啶核苷(Thymidine,MW 242.2)，加超纯水或四蒸水至100ml，置45-50℃水浴中使完全溶解，过滤除菌，分装小瓶（2ml/瓶），-20℃冻存。用前可置37℃加温助溶。

d、 L-谷氨酰胺（L.G.）溶液（100×，0.2mol/L） : 称取2.92g L-谷氨酰胺（L-glutamine，MW 146.15），用100ml不完全培养液或超纯水（或四蒸水）溶解，过滤除菌，分装小瓶（4-5ml/瓶），-20℃冻存。

e、 青、链霉素（双抗）溶液（100×）: 取青霉素G（钠盐）100万单位和链霉素（硫酸盐）1g，溶于100ml灭菌超纯水或四蒸水中，分装小瓶（4-5ml/瓶），-20℃冻存。

f、 7.5% NaHCO3溶液 : 称取分析纯NaHCO3 7.5g，溶于100ml超纯水或四蒸水中，过滤除菌，分装小瓶（4-5ml/瓶），盖紧瓶塞，4℃保存。

g、 HEPES溶液（1mol/L）: 称取23.83g HEPES（N-2-Hydroxyethylpiperazine-N，-2-ethanesulfonic acid，N-2-羟乙基哌嗪- N，-2-乙基磺酸，MW 238.3）溶于100ml超纯水或四蒸水中，过滤除菌，分装小瓶（4-5ml/瓶），4℃保存。

h、 8-氮鸟嘌呤贮存液（100×）: 称取200mg 8-氮鸟嘌呤（8-azaguanine，MW 152.1），加入4mol/L NaOH 1ml，待其溶解后，加入超纯水或四蒸水99ml，过滤除菌；分装小瓶，-20℃冻存。使用时按1%浓度加入到培养液中（即终浓度为20ug/ml）。

g. 用新配制的10% Giemsa染液染色10-20分钟，然后用自来水洗去染液，自然干燥。（Giemsa染液配方：Giemsa粉0.5g，甘油33ml，55-60℃保温2小时，加甲醇33ml混匀，保存于棕色瓶内作为原液；取原液1份，加1/15mol/L PH6.8 PBS 9份，即成10% Giemsa染液）。

h. 镜检：选择染色体分散好，无重叠，无失散的细胞进行观察分析。每份标本应计数100个完整的中期核细胞，并注意观察是否有标志染色体。

i、 50% PEG: 称取PEG 1000 或4000 20-50g于三角瓶中，盖紧，60-80℃水浴融化，0.6ml分装于青霉素小瓶中，盖紧，8磅高压蒸汽15分钟，-20℃存放备用。临用前加热融化，加等量不完全培养基，用少许7.5% NaHCO3调PH至8.0，或购买Sigma或Gibco公司现成产品。

⑵ 髓瘤细胞的准备
融合前骨髓瘤细胞维持的方式，对成功地得到杂交瘤是最为重要的。目标是使细胞处于对数生长的时间尽可能长，融合前肯定不能少于1周。冻存的细胞在复苏后要2周时间才能处于适合于融合的状态，长过了的骨髓瘤细胞至少几天才可能恢复。在实验室中处于对数生长的骨髓瘤细胞维持在含10%小牛血清的培养基中，方法是用6个装5ml培养基的培养瓶，接种10倍系列稀释的骨髓瘤细胞。1周后到细胞相当密而又未长过的一瓶重新移植。典型的倍增时间为14-16小时。
骨髓瘤细胞悬液的制备方法如下：
a、于融合前48-36小时，将骨髓细胞扩大培养（一般按一块96孔板的融合试验约需2-3瓶100ml培养瓶培养的细胞进行准备）。
b、融合当天，用弯头滴管将细胞从瓶壁瘤轻轻吹下，收集于50ml离心管或融合管内。
c、 1000r/min离心5-10分钟，弃去上清。
d、加入30ml不完全培养基，同法离心洗涤一次。然后将细胞重悬浮于10ml不完全培养基，混匀。
e、取骨髓瘤细胞悬液，加0.4%台盼蓝染液作活细胞计数后备用。细胞计数时，取细胞悬液0.1ml加入0.9ml台盼蓝染液中，混匀，用血球计数板计数。计算细胞数目的公式为：每毫升细胞数=4个大方格细胞数×105/4；或每毫升细胞数=5个中方格细胞数×106/2

⑶ 脾淋巴细胞的准备
取已经免疫的BALB/c小鼠，摘除眼球采血，并分离血清作为抗体检测时的阳性对照血清。同时通过颈脱位致死小鼠，浸泡于75%酒精中5分钟，于解剖台板上固定后掀开左侧腹部皮肤，可看到脾脏，换眼科剪镊，在超净台中用无菌手术剪剪开腹膜，取出脾脏置于已盛有10ml不完全培养基的平皿中，轻轻洗涤，并细心剥去周围结缔组织。将脾脏移入另一盛有10ml不完全培养基的平皿中，用弯头镊子或装在1ml注射器上的弯针头轻轻挤压脾脏（也可用注射器内芯挤压脾脏），使脾细胞进入平皿中的不完全培养基。用吸管吹打数次，制成单细胞悬液。为了除去脾细胞悬液中的大团块，可用200目铜网过滤。收获脾细胞悬液，1000r/min离心5-10分钟，用不完全培养基离心洗涤1-2次，然后将细胞重悬于10ml不完全培养基混匀，取上述悬液，加台酚蓝染液作活细胞计数后备用。通常每只小鼠可得1×108-2.5×108个脾细胞，每只大鼠脾脏可得5×108-10×108脾细胞。

⑷ 饲养细胞（Feeder cells）的制备
在细胞融合后选择性培养过程中，由于大量骨髓瘤细胞和脾细胞相继死亡，此时单个或少数分散的杂交瘤细胞多半不易存活，通常必须加入其他活细胞使之繁殖，这种被加入的活细胞称为饲养细胞。饲养细胞促进其他细胞增殖的机制尚不明了，一般认为它们可能释放非种属特异性的生长刺激因子，为杂交瘤细胞提供必要的生长条件；也可能是为了满足新生杂交瘤细胞对细胞密度的依赖性。
常用的饲养细胞有胸腺细胞、正常脾细胞和腹腔巨噬细胞。其中以小鼠腹腔巨噬细胞的来源及制备较为方便，且有吞噬清除死亡细胞及其碎片的作用，因此使用最为普遍。其制备方法如下：
按上述采小鼠脾细胞的方法将小鼠致死、体表消毒和固定后，用消毒剪镊从后腹掀起腹部皮肤，暴露腹膜。用酒精棉球擦拭腹膜消毒。用注射器注射10ml不完全培养基至腹腔，注意避免穿入肠管。右手固定注射器，使针头留置在腹腔内，左手持酒精棉球轻轻按摩腹部1分钟，随后吸出注入的培养液。1000r/min离心5-10分钟，弃上清。先用5ml HAT培养基将沉淀细胞悬浮，根据细胞计数结果，补加HAT培养基，使细胞浓度为2×105/ml，备用。通常对巨噬细胞来说，96孔培养板每孔需2×104个细胞，24孔板每孔需105细胞。每只小鼠可得3-5×106个细胞，因此一只小鼠可供两块96孔板的饲养细胞。也可在细胞融合前1-2天制备并培养饲养细胞，这样使培养板孔底先铺上一层饲养细胞层。做法是，将上述细胞悬液加入96孔板，每孔0.1ml（相当于2滴），然后置37℃ 6% CO2的培养箱中培养。

⑸ 细胞融合与杂交瘤细胞的选择性培养
细胞融合的程序已报道的有很多种，这里介绍的是作者所在实验室常用的一种。
A、将1×108脾细胞与2×107-5×107骨髓瘤细胞SP2/0-Ag14混合于一支50ml融合管中，补加不完全培养基至30ml，充分混匀。
B、 1000r/min离心5-10分钟，将上清尽量吸净。
C、在手掌上轻击融合管底，使沉淀细胞松散均匀;置40℃水浴中预热。
D、用1ml吸管在1分钟左右（最佳时间为45秒）加预热至40℃的50% PEG（PH 8.0）1ml，边加边轻轻搅拌。
E、用10ml吸管在90秒内加20-30ml预热至37℃的不完全培养基；20-37℃静置10分钟。
F、 1000r/min 5分钟；弃去上清。
G、 加入5ml HAT培养基，轻轻吹吸沉淀细胞，使其悬浮并混匀，然后补加含腹腔巨噬细胞的HAT培养基至80-100ml。
H、分装96孔细胞培养板，每孔0.10-0.15ml；分装24孔板，每孔1.0-1.5ml；然后将培养板置37℃，6% CO2培养箱内培养。
I、 5天后用HAT培养基换出1/2培养基。
J、 7-10天后用HT培养基换出HAT培养基；（第14天后可用普通完全培养基）。
L、经常观察杂交瘤细胞生长情况，待其长至孔底面积1/10以上时吸出上清供抗体检测。

3、杂交瘤细胞筛选

杂交瘤细胞在融合后2周左右即可筛选，即把分泌所需抗体的杂交瘤孔从众多的孔中选出来，通常也称为抗体检测。抗体检测的方法很多，通常根据所研究的抗原和实验室的条件而定。但作为杂交瘤筛选的抗体检测方法必须具有快速、准备、简便，便于一次处理大量样品等特点。因为往往有几百个样品需要在短短几个小时就报告结果，以便决定杂交瘤细胞的取舍。所以选用抗体检测方法的原则是快速、敏感、特异、可靠、花费小和节省人力。一般说来，在融合之前就必须建立好抗体检测方法，并克服可能存在的问题。另一个重要问题是抗体检测方法所需要的“动力学范围”，即检出背景以上的最强与最弱信号之比，依所用的检测抗原是否纯净而定。如杂交瘤抗体是针对纯化的蛋白质抗原的，100%的抗原参与反应，一个阳性/阴性判别系统就够了。另一方面，如果杂交瘤抗体是针对细胞表面微量的蛋白抗原，检测系统可能需要能测出微弱信号，则动力学范围至少应为10：1，最好为100：1。另外，检测方法的选择还受所需杂交瘤抗体的类型和预定的用途的影响。结合补体的抗体可以用基于细胞毒性反应的检测方法来选出。如需结合A蛋白的杂交瘤抗体，就要用结合蛋白A的检测方法。

下面简要介绍几种常用的抗体检测方法：

⑴ 免疫酶技术

免疫酶技术是将抗原抗体反应的特异性和酶对底物显色反应的高效催化作用有机结合而成的免疫学技术。由于它特异性强，灵敏度高，现已广泛用于筛选和鉴定单抗。

A、器材和试剂

a. 包被缓冲液：

碳酸盐缓冲液：取0.2mol/L Na2CO3 8ml，0.2mol/L NaHCO3 17ml混合，再加75ml蒸馏水，调PH至9.6。

Tris-HCl缓冲液（PH8.0，0.02mol/L）：取0.1mol/L Tris 100ml，0.1mol/L HCl 58.4ml混合，加蒸馏水至1000ml。

b. 洗涤缓冲液（PH7.2的PBS）：KH2PO4 0.2g，KCl 0.2g，Na2HPO4"12H2O 2.9g，NaCl 8.0g，Tween-20 0.5ml，加蒸馏水至1000ml。

c. 稀释液和封闭液：牛血清白蛋白（BSA）0.1g，加洗涤液至100ml；或用洗涤液将小牛血清配成5-10%使用。

d. 酶反应终止液（2mol/L H2SO4）：取蒸馏水178.3ml，滴加浓硫酸（98%）21.7ml。

e. 底物缓冲液（PH5.0，磷酸盐-柠檬酸缓冲液）：取0.2mol/L Na2HPO4 25.7ml，0.1ml/L柠檬酸24.3ml，再加50ml蒸馏水。柠檬酸溶液及配成的底物缓冲液不稳定，易形成沉淀，因此一次不宜配制过多。

f. 底物使用液：

OPD底物使用液（测490nm的OD值）：OPD 5mg，底物缓冲液10ml，3% H2O2 0.15ml。

TMBS或TMB底物使用液（测450nm的OD值）：TMBS或TMB（1mg/ml）1.0ml，底物缓冲液10ml，1% H2O2 25ul。

ABTS底物使用液（测410nm的OD值）：ABTS 0.5mg，底物缓冲液1ml，3% H2O2 2ul。

g. 抗体对照：以骨髓瘤细胞培养上清作为阴性对照，以免疫鼠血清作为阳性血清。

h. 抗原：可溶性抗原：尽量纯化，以获得高特异性。

病毒感染的传代细胞或全菌抗原。

淋巴细胞等悬液。

i. 酶标抗鼠抗体或酶标SPA或其他类似试剂。

j. 细胞固定液：-20℃丙酮；或丙酮-甲醛固定液：Na2HPO4 100mg，KH2PO4 500mg，蒸馏水150ml，丙酮225ml，甲醛125ml；或丙酮-甲醛溶液（1;1）；或-20℃甲醇。

k. 聚苯乙烯微孔板：40孔、96孔、或条孔；硬板或软板均可使用。

l. 酶联免疫阅读仪；或光镜。

m. 吸管、加样器及水浴箱、离心机等。

B、 可溶性抗原的酶联免疫吸附试验（ELISA）

a. 纯化抗原用包被液稀释至1-20ug/ml。

b. 以50-100ul/孔量加入酶标板孔中，置4℃过夜或37℃吸附2小时。

c. 弃去孔内的液体，同时用洗涤液洗3次，每次3-5分钟，拍干。

d. 每孔加200ul封闭液4℃过夜或37℃封闭2小时；该步骤对于一些抗原，可省略。

e. 洗涤液洗3次；此时包被板可-20℃或4℃保存备用。

f. 每孔加50-100ul待检杂交瘤细胞培养上清，同时设立阳性、阴性对照和空白对照；37℃孵育1-2小时；洗涤，拍干。

g. 加酶标第二抗体，每孔50-100ul，37℃孵育1-2小时，洗涤，拍干。

h. 加底物液，每孔加新鲜配制的底物使用液50-100ul，37℃10-30分钟。

i. 以2mol/L H2SO4终止反应，在酶联免疫阅读仪上读取OD值。

j. 结果判定：以P/N≥2.1，或P≥N 3D为阳性。若阴性对照孔无色或接近无色，阳性对照孔明确显色，则可直接用肉眼观察结果。

C、 全菌抗原的ELISAS

a. 新鲜培养的细菌用蒸馏水或PBS悬浮，并调整细菌浓度至1×108个/ml。必须指出，对于人畜共患病病原体需注意安全操作，最好是灭活处理。

b. 每孔中加100ul 5%戊二醛溶液（0.1mol/L NaHCO3 95ml 25%戊二醛溶液5ml），37℃作用2小时，蒸馏水洗涤3次；加上述细菌悬液50ul/孔；37-56℃烘干；每孔加200ul封闭液4℃过夜或37℃ 2小时封闭。

c. 步骤b也可采用先每孔加50ul细菌悬液，37℃-56℃烘干，然后用-20℃预冷的无水甲醇室温作用15分钟，蒸馏水洗涤3次；每孔加200ul封闭液4℃过夜或37℃ 2小时封闭。

d. 洗涤液洗3次；此时包被板可在-20℃或4℃保存备用。

e. 以下步骤同上法。

D、 用全细胞抗原的ELISA

a. 按常规方法培养细胞，接种病毒，收获感染细胞和未感染细胞，进行细胞计数，用PBS制成适当浓度悬液。

b. 淋巴细胞悬液的制备采用新鲜外周血加肝素抗凝后，滴加于淋巴细胞分离液之上，1500rpm离心30分钟，吸取界面细胞洗涤二次，即为新鲜淋巴细胞悬液。该细胞悬液中若仍混有红细胞，离心后加0.83%的氯化铵溶液，室温10分钟，洗涤一次即可。将该细胞悬液稀释至适当浓度。

c. 每孔加100ul上述a或b的细胞悬液，使每孔含细胞5×104个；1500r/min 15分钟，甩去上清；室温干燥或吹干后用丙酮-甲醇（1：1）4℃固定10分钟；可4℃或-20℃保存备用。

d. 以下步骤同上法。

E、抗体捕捉ELISA试验

本法用抗BALB/c小鼠Ig的多克隆抗体捕捉待检样品中的McAb，再依次加抗原、酶标多克隆抗体及底物显色。该法是常用的ELISA中较理想的一种；其操作步骤如下：

a. 以适当浓度的纯化抗鼠Ig抗体包被酶标板，每孔加100ul，37℃ 2小时或4℃过夜。

b. 洗涤、拍干后加待测的McAb样品，37℃ 1-2小时。

c. 洗涤后加适量的抗原，37℃ 1-2小时。

d. 洗涤后加入酶标多克隆抗体，37℃ 1-2小时。洗涤后加底物显色，判定结果。

3、骨髓瘤细胞培养液

培养基的成分过于复杂，都是买现成的粉末，然后会加双蒸水配置，根据说明书添加其专他一些成分，过滤除属菌，再加适当比例血清。
复苏时，先准备好37度水浴锅。然后将冻存管从液氮中取出，用PE手套包好，迅速放入37度水浴锅，不断晃动，迅速解冻。在超净台内将液体吸出移入ep管离心收集细胞，弃上清，用新鲜培养基重悬转入细胞培养瓶，补加适量培养基。
注意事项：37度水浴要准确，解冻要迅速，注意无菌，离心转速不要超过1200g等。
传代时间要看起始密度，你可以根据细胞周期算，因为是肿瘤细胞，其生长周期不到24小时。

4、hbl-100细胞用什么培养基

培养某一类型细胞没有固定的培养条件。在MEM中培养的细胞，很可能在DMEM或M199中同样很容易生长。总之，首选MEM做粘附细胞培养、RPMI-1640做悬浮细胞培养，各种目的无血清培养的首选是AIM V培养基（SFM）。在开始进行新的细胞培养时，可以参考下表所列的条件：
细胞系 细胞类型 种 组织 使用的培养基
293 成纤维细胞 人 胚胎肾 MEM, 10% 热灭活马血清
3T6 成纤维细胞 小鼠 胚胎 DMEM, 10% 胎牛血清
A549 上皮细胞 人 肺癌 F-12K, 10%胎牛血清
A9 成纤维细胞 小鼠 结缔组织 DMEM, 10%胎牛血清
AtT-20 上皮细胞 小鼠 垂体肿瘤 F-10, 15% 马血清和2.5% 胎牛血清
BALB/3T3 成纤维细胞 小鼠 胚胎 DMEM, 10% 胎牛血清
BHK-21 成纤维细胞 仓鼠 肾 GMEM, 10% 胎牛血清 或MEM, 10% 胎牛血清 和NEAA
BHL-100 上皮细胞 人 乳房 McCoy'5A, 10% 胎牛血清
BT 成纤维细胞 牛 鼻甲骨细胞 MEM, 10% 胎牛血清 和 NEAA
Caco-2 上皮细胞 人 结肠腺癌 MEM, 20% 胎牛血清 和NEAA
Chang 上皮细胞 人 肝脏 BME, 10% 小牛血清
CHO-K1 上皮细胞 仓鼠 F-12, 10% 胎牛血清
Clone 9 上皮细胞 大鼠 肝脏 F-12K, 10% 胎牛血清
Clone M-3 上皮细胞 小鼠 黑素瘤 F-10, 15% 马血清和 2.5% 胎牛血清
COS-1 成纤维细胞 猴 肾 DMEM, 10% 胎牛血清
COS-3 成纤维细胞 猴 肾 DMEM, 10% 胎牛血清
COS-7 成纤维细胞 猴 肾 DMEM, 10% 胎牛血清
CRFK 上皮细胞 猫 肾 MEM, 10% 胎牛血清 和NEAA
CV-1 成纤维细胞 猴 肾 MEM, 10% 胎牛血清
D-17 上皮细胞 狗 骨肉瘤 MEM, 10% 胎牛血清 和NEAA
Daudi 成淋巴细胞 人 淋巴瘤病人血液 RPMI-1640, 10% 胎牛血清
GH1 上皮细胞 大鼠 垂体肿瘤 F-10, 15% 马血清和 2.5% 胎牛血清
GH3 上皮细胞 大鼠 垂体肿瘤 F-10, 15% 马血清和2.5% 胎牛血清
H9 成淋巴细胞 人 T细胞淋巴瘤 RPMI-1640, 20% 胎牛血清
HaK 上皮细胞 仓鼠 肾 BME, 10% 小牛血清
HCT-15 上皮细胞 人 结肠直肠腺癌 RPMI-1640, 10% 胎牛血清
HeLa 上皮细胞 人 子宫颈癌 MEM, 10% 胎牛血清 和NEAA (in suspension, S-MEM)
HEp-2 上皮细胞 人 喉 癌 MEM, 10% 胎牛血清
HL-60 成淋巴细胞 人 早幼粒细胞白血病 RPMI-1640, 20% 胎牛血清
HT-1080 上皮细胞 人 纤维肉瘤 MEM, 10% HI 胎牛血清 和NEAA
HT-29 上皮细胞 人 结肠腺癌 McCoy's 5A, 10% 胎牛血清
HUVEC 内皮细胞 人 脐带 F-12K, 10% 胎牛血清 和 肝素盐 100 ug/ ml
I-10 上皮细胞 小鼠 睾丸癌 F-10, 15% 马血清和 2.5% 胎牛血清
IM-9 成淋巴细胞 人 骨髓瘤病人骨髓 RPMI-1640, 10% 胎牛血清
JEG-2 上皮细胞 人 绒毛膜癌 MEM, 10% 胎牛血清
Jensen 成纤维细胞 大鼠 肉瘤 McCoy's 5A, 5% 胎牛血清
Jurkat 成淋巴细胞 人 淋巴瘤 RPMI-1640, 10% 胎牛血清
K-562 成淋巴细胞 人 骨髓性的白血病 RPMI-1640, 10% 胎牛血清
KB 上皮细胞 人 口腔癌 MEM, 10% 胎牛血清 和NEAA
KG-1 骨髓白细胞 人 红白血病病人骨髓 IMDM, 20% 胎牛血清
L2 上皮细胞 大鼠 肺 F-12K, 10%胎牛血清
L6 大鼠 骨骼肌成肌细胞 DMEM, 10% 胎牛血清
LLC-WRC 256 上皮细胞 大鼠 癌 Medium 199, 5% 马血清
McCoy 成纤维细胞 小鼠 未知 MEM, 10% 胎牛血清
MCF7 上皮细胞 人 癌 MEM, 10% 胎牛血清 NEAA, 10ug/ml 胰岛素
WEHI-3b 类巨噬细胞 小鼠 骨髓单核细胞白血病 DMEM, 10% 胎牛血清
WI-38 上皮细胞 人 胚胎肺 BME, 10% 胎牛血清
WISH 上皮细胞 人 羊膜 BME, 10% 胎牛血清
WS1 人 胚胎皮肤 MEM, 10% 胎牛血清 和NEAA
XC 上皮细胞 大鼠 肉瘤 MEM, 10% 胎牛血清 和NEAA
Y-1 上皮细胞 小鼠 肾上腺瘤 F-10, 15% 马血清和 2.5% 胎牛血清

5、请问哪位老师知道多发性骨髓瘤细胞株RPMI8226都有那些特点？是否具有平常所说的那些特点？比如是

K

6、有关培养基的知识？！

培养基（Medium）是供微生物、植物和动物组织生长和维持用的人工配制的养料，一般都含有碳水化合物、含氮物质、无机盐（包括微量元素）以及维生素和水等。有的培养基还含有抗菌素和色素，用于单种微生物培养和鉴定。
简介
培养基（Medium）是供微生物、植物和动物组织生长和维持用的人工配制的养料，一般都含
培养基
有碳水化合物、含氮物质、无机盐（包括微量元素）以及生长素和水等。有的培养基还含有抗菌素、色素、激素和血清。
培养基由于配制的原料不同，使用要求不同，而贮存保管方面也稍有不同。一般培养基在受热、吸潮后，易被细菌污染或分解变质，因此一般培养基必须防潮、避光、阴凉处保存。对一些需严格灭菌的培养基（如组织培养基），较长时间的贮存，必须放在2~6℃的冰箱内。由于液体培养基不易长期保管，现在均改制成粉末。

化学分类
固体培养基
天然培养基
指一类利用动、植物或微生物体包括其提取物制成的培养基。如牛肉膏蛋白胨培养基、麦芽汁培养基等。
组合培养基
又称为合成培养基或综合培养基，是一类按微生物的营养要求精确设计后用多种高纯化学试剂配制成的培养基。如葡萄糖铵盐培养基、淀粉硝酸盐培养基等。
半组合培养基
指一类主要以化学试剂配制，同时还加有某种或某些天然成分的培养基。例如，马铃薯蔗糖培养基。

物理分类
液体培养基
一类配制成的液体状态的基质。
液体培养基
固体培养基
一类配制成的固体状态的基质。根据性质又分为固化培养基、非可逆性固化培养基、天然固态培养基、滤膜。
半固体培养基　
指在液体培养基中加入少量的凝固剂而配制成的半固体状态的培养基。
脱水培养基
又称预制干燥培养基，指含有除水分外的一切成分的商品培养基。

微生物分类
选择性培养基：一类根据某微生物的特殊营养要求或其对某化学、物理因素的抗性而设计的培养基，具有使混合菌样中的劣势菌变成优势菌的功能，广泛用于菌种筛选等领域。
鉴别培养基：一类在成分中加有能与目的菌的无色代谢产物发生显色反应的指示剂，从而达到只须用肉眼辨别颜色就能方便的从近似菌落中找出目的菌菌落的培养基。例如，伊红美蓝乳糖培养基（EMB）。

常见培养基
细菌培养基
牛肉膏琼脂培养基
牛肉膏0.3g，蛋白胨1.0g，氯化钠0.5g，琼脂 1.5g，水 100ml
在烧杯内加水100毫升，放入牛肉膏、蛋白胨和氯化钠，用蜡笔在烧杯外作上记号后，放在火上加热。待烧杯内各组分溶解后，加入琼脂，不断搅拌以免粘底。等琼脂完全溶解后补足失水，用10%盐酸或10%的氢氧化钠调整pH值到7.2～7.6,分装在各个试管里，加棉花塞，用高压蒸汽灭菌：1.05千克每平方厘米、121摄氏度维持15~30分钟。
马铃薯培养基
取新鲜牛心（除去脂肪和血管）250克，用刀细细剁成肉末后，加入500毫升蒸馏水和5克蛋白胨。在
细菌培养基
烧杯上做好记号，煮沸，转用文火炖2小时。过滤，滤出的肉末干燥处理，滤液pH值调到7.5左右。每支试管内加入10毫升肉汤和少量碎末状的干牛心，灭菌，备用。
根瘤菌培养基
葡萄糖10g磷酸氢二钾0.5g 碳酸钙3g 硫酸镁0.2g 酵母粉0.4g 琼脂20g 水1000ml 1%结晶紫溶液1ml
先把琼脂加水煮沸溶解，然后分别加入其他组分，搅拌使溶解后，分装，灭菌，备用。
放线菌培养基
淀粉硝酸盐培养基（高氏一号培养基）
可溶性淀粉 2.0g 硝酸钾0.1g 磷酸氢二钾0.05g氯化钠0.05g 硫酸镁0.05g 硫酸亚铁0.001g 琼脂2g 水100ml
先把淀粉放在烧杯里，用5毫升水调成糊状后，倒入95毫升水，搅匀后加入其他药品，使它溶解。在烧杯外做好记号，加热到煮沸时加入琼脂，不停搅拌，待琼脂完全溶解后，补足失水。调整pH值到7.2～7.4，分装后灭菌，备用。
面粉琼脂培养基
面粉60g琼脂20g 水1000ml
把面粉用水调成糊状，加水到500ml，放在文火上煮30分钟。另取500ml水，放入琼脂，加热煮沸到溶解后，把两液调匀，补充水分，调整pH值到7.4，分装，灭菌，备用。
微藻培养基
BG-11培养基
NaNO31.5g K2HPO4 ·3H2O 0.04g MgSO4·7H2O0.075g CaCl2 ·2H2O 0.036g Citric Acid （柠檬酸 ）0.006g Ferric ammonium citrate（柠檬酸铁铵）0.006gEDTA (dinatrium-salt) 0.001g Na2CO3 0.02g A5 + Co solution * （A5溶液1000×）1mlDistilled Water （蒸馏水）919ml
SE培养基

NaNO3

0.25g

K2HPO4 . 3H2O

0.075g

MgSO4 . 7H2O

0.075g

CaCl2 . 2H2O

0.025g

KH2PO4

0.175g

NaCl

0.025

Soil extract

40ml

FeCl3·6H2O

0.005

Fe—EDTA

1ml

A5 solution 1000×

1ml

distilled water

958ml

Soil Extract(土壤提取液)配置方法
取花园土未施过肥0。5kg置于烧杯或三角瓶中，加入蒸馏水1000毫升，瓶口用透气塞封口，在水浴中沸水加热2小时，冷却数小时，在无菌条件下过滤，取上清液，将灭菌蒸馏水加入上清液至总体积1000毫升。土壤提取液保存在4ºC备用。
Compositionof the A5 solution
Addto 100 ml of distilled water:

H3BO3

286 mg

MnCl2 . 4H2O

181 mg

ZnSO4 . 7H2O

22 mg

CuSO4 . 5 H2O

7.9 mg

(NH4）6Mo7O24 .4H2O

3.9 mg

EDTA-Fe的配置方法：
将EDTA和FeCl3·6H2O分别溶于水和HCl(0.1N),混匀即可。

Na2EDTA

1g

distilled water

50ml

FeCl3·6H2O

81 mg

HCl（0.1N）

50ml

Pr培养基
Preparation:to 997 mL of glass-distilled water, add 1.0 g proteose peptone, 15.0 g agar,and the following stock solutions:

working solution

g/1000 mL H2O

NaNO3

0.25

CaCl2. 2H2O

0.025

MgSO4. 7H2O

0.075

K2HPO4

0.075

KH2PO4

0.175

NaCl

0.025

A5 solution

1ml

EDTA-Fe

1ml

FeCl3 (0.05%)

1ml

A5溶液和EDTA-Fe溶液配制方法同上。
真菌培养基
萨市（Sabouraud’s）培养基
蛋白胨10g 琼脂20g 麦芽糖 40g 水1000ml
先把蛋白胨、琼脂加水后，加热，不断搅拌，待琼脂溶解后，加入40g麦芽糖（或葡萄糖），搅拌，使它溶解，然后分装，灭菌，备用。
本培养菌是培养许多种类真菌所常用的。
马铃薯糖琼脂培养基
把马铃薯洗净去皮，取200g切成小块，加水1000ml，煮沸半小时后，补足水分。在滤液中加入10g琼脂，煮沸溶解后加糖20g（用于培养霉菌的加入蔗糖，用于培养酵母菌的加入葡萄糖），补足水分，分装，灭菌，备用。
把这培养基的pH值调到7.2～7.4，配方中的糖，如用葡萄糖还可用来培养放线菌和芽孢杆菌。
豆芽汁培养基
黄豆芽100g琼脂15 g 葡萄糖20g 水1000ml
洗净黄豆芽，加水煮沸30分钟。用纱布过滤，滤液中加入琼脂，加热溶解后放入糖，搅拌使它溶解，补足水分到1000ml，分装，灭菌，备用。
把这培养基的pH值调到7.2～7.4，可用来培养细菌和放线菌。
豌豆琼脂培养基
豌豆80粒琼脂 5g 水200ml
取80粒干豌豆加水，煮沸1小时，用纱布过滤后，在滤液中加入琼脂，煮沸到溶解，分装，灭菌，备用。
琼脂
食用菌菌种培养基
马铃薯-蔗糖-琼脂培养基
20%马铃薯煮汁 1000ml 蔗糖20g 琼脂18g
把马铃薯洗净去皮后，切成小块。称取马铃薯小块200g，加水1000ml，煮沸20分钟后，过滤。在滤汁中补足水分到1000ml，即成20%马铃薯煮汁。在马铃薯煮汁中加入琼脂和蔗糖，煮沸，使它溶解后，补足水分，分装，灭菌，备用。使用该培养基对pH值要求不严格，可以不测定。
综合马铃薯培养基
20%马铃薯煮汁1000 ml 磷酸二氢钾3g 硫酸镁1.5g葡萄糖20g 维生素10mg 琼脂18g
先配制20%马铃薯煮汁，方法同上。在煮汁中加入上述各种组分，加热溶解后补足水分，调整pH值到6。分装，灭菌，备用。 该培养基用于培养和保存灵芝、平菇、香菇等食用菌菌种。
烟草的培养基
在植物组织培养时，通过调节IAA和CTK的比值能影响愈伤组织分化出根或芽。CTK/IAA高时,愈伤组织分化芽
CTK/IAA低时，分化根；CTK/IAA比例适中维持愈伤组织不分化
愈伤组织诱导培养基制备
以MS培养基母液为基础,向洁净铝锅中顺序加入大量元素20×母液100mL,微量元素100×母液20mL,铁盐100×母液20mL ,维生素100×母液20mL,肌醇200×母液10mL,甘氨酸200×母液10mL,配制得MS培养基后，再加入0.5mg·L-1的BA8mL,0.5mg·L-1的NAA8mL.然后加入实际配制培养基体积约2/3-3/4的蒸馏水，加入40g蔗糖后搅拌使其溶化,用0.5mol·L-1的NaOH和0.5 mol·L-1的HCl调整pH值至5.8-6.0.加入14g琼脂，将铝锅置于电炉上,搅拌加热使琼脂完全溶化，然后用蒸馏水定容至终体积2L,继续加热几分钟使之混合均匀后分装于三角瓶中。
烟草叶片愈伤组织诱导
烟草
取一无菌培养皿，用解剖刀切取1-2片无菌苗叶片置于无菌培养皿中,并用解剖刀将叶片切成2mm2左右的小片，然后将其接种于准备好的培养基上,每瓶接种5小片，一共接种6瓶。接种后的三角平置于24条件下黑暗培养1周,然后在同样温度下有光照和全黑暗下培养3周直至愈伤组织形成(两种情况各置3瓶).观察愈伤组织诱导结果，统计愈伤组织诱导率。
器官分化及植株再生培养
将诱导的愈伤组织按类型分别转入分化培养基上,置于连续光照，温度20-22 C条件下培养3周,统计愈伤组织再生植株情况.
愈伤组织诱导的总体情况
烟草愈伤组织诱导培养4周后,愈伤组织基本形成，即排除因生长时间不够而未形成愈伤的情况。具体情况见表一中所示,6瓶培养物均有愈伤形成，且都未发生污染,但诱导率几乎各不相同.其中， 在光照条件下培养的3瓶平均愈伤诱导率为60.0℅, 在黑暗条件下培养的3瓶平均愈伤诱导率为46.7%.由于实验过程中，外植体即烟草叶片取得偏小,接种时可能已有部分外植体的大部分细胞脱水死亡，使整个实验的愈伤组织诱导率偏低,愈伤块偏小。
动物细胞培养基
RPMI1640培养基是一个全营养型培养基，广泛应用于哺乳动物细胞和杂交瘤细胞的培养，如人骨髓瘤细胞、鼠杂交瘤细胞、人白细胞以及B细胞和T细胞。最初设计用于悬浮细胞培养和人白血病细胞的单层细胞培养。

特殊培养基
选择性培养基
选择性培养基是指根据某种微生物的特殊营养要求或其对某化学、物理因素的抗性而设计的培养基。其功能是使混合菌样中的劣势菌变成优势菌，从而提高该菌的筛选效率。
酵母菌富集培养基
葡萄糖5%尿素0.1% 硫化铵0.1% 磷酸二氢钾0.25% 磷酸氢二钠0.05% 七水合硫酸镁0.1% 七水合硫酸铁0.01% 酵母膏0.05%孟加拉国红0.003% pH4.5
Ashby无氮培养基
富集好氧自生固氮菌
甘露醇1%磷酸二氢钾0.02% 七水合硫酸镁0.02% 氯化钠0.02% 二水合硫酸钙0.01% 碳酸钙0.5%

鉴别培养基
EMB培养基
　常用于鉴别E.coli
蛋白胨10g乳糖5g 蔗糖5g 磷酸氢二钾2g 伊红Y 0.4g 美蓝0.065g蒸馏水1000g pH7.2
2216E培养基配方
分离海洋微生物的培养基配方
蛋白胨5g 酵母膏1g 磷酸高铁 0.01g 琼脂15~20g 陈海水 1000ml 煮沸氢氧化钠（5%）的溶液调PH值7.6~7.8
伊红美蓝培养基
可用于检测水中大肠杆菌的含量
首先按以下组成配制基础培养基。
蛋白胨10gNaCl 5g
琼脂15~20g
将上述物质溶解后，用蒸馏水定容至1000mL，调节pH为7.6.灭菌后，冷却至60℃左右，再按下面的比例，在无菌操作条件下加入灭菌的乳糖溶液、伊红水溶液以及美蓝水溶液。摇匀后，立即倒平板。溶液中的乳糖在高温下会破坏，因此一般使用压力为70kPa、温度为115℃的条件灭菌20min.
基础培养基 100mL 20%乳糖溶液2mL
2%伊红水溶液 2mL 0.5%美蓝水溶液1mL

天然细胞培养基——血清
天然培养基是指来自动物体液或利用组织分离提取的一类培养基，如血浆、血清、淋巴液、鸡胚浸出液等。组织培养技术建立早期，体外培养细胞都是利用天然培养基。但是由于天然培养基制作过程复杂、批间差异大，因此逐渐为合成培养基所替代。目前广泛使用的天然培养基是血清，另外各种组织提取液、促进细胞贴壁的胶原类物质在培养某些特殊细胞也是必不可少。
血清种类
目前用于组织培养的血清主要是牛血清，培养某些特殊细胞也用人血清、马血清等。选择用牛血清培养细胞的原因：来源充足、制备技术成熟、经过长时间的应用考验人们对其有比较深入的理解。牛血清对绝大多数哺乳动物细胞都是适合的，但并不排除在培养某种细胞时使用其他动物血清更合适。
牛血清是细胞培养中用量最大的天然培养基，含有丰富的细胞生长必须的营养成份，具有极为重要的功能。牛血清分为小牛血清、新牛血清、胎牛血清。胎牛血清应取自剖腹产的胎牛；新牛血清取自出生24小时之内的新生牛；小牛血清取自出生10－30天的小牛。显然，胎牛血清是质量最高的，因为胎牛还未接触外界，血清中所含的抗体、补体等对细胞有害的成分最少。
血清的主要成分
血清样本
血清是由血浆去除纤维蛋白而形成的一种很复杂的混合物，其组成成份虽大部分已知，但还有一部分尚不清楚，且血清组成及含量常随供血动物的性别、年龄、生理条件和营养条件不同而异。血清中含有各种血浆蛋白、多肽、脂肪、碳水化合物、生长因子、激素、无机物等，这些物质对促进细胞生长或抑制生长活性是达到生理平衡的。
血清主要作用
1．提供基本营养物质：氨基酸、维生素、无机物、脂类物质、核酸衍生物等，是细胞生长必须的物质。
2．提供激素和各种生长因子：胰岛素、肾上腺皮质激素（氢化可的松、地塞米松）、类固醇激素（雌二醇、睾酮、孕酮）等。生长因子如成纤维细胞生长因子、表皮生长因子、血小板生长因子等。
3．提供结合蛋白：结合蛋白作用是携带重要地低分子量物质，如白蛋白携带维生素、脂肪、以及激素等，转铁蛋白携带铁。结合蛋白在细胞代谢过程中起重要作用。
4．提供促接触和伸展因子使细胞贴壁免受机械损伤。
5．对培养中的细胞起到某些保护作用：有一些细胞，如内皮细胞、骨髓样细胞可以释放蛋白酶，血清中含有抗蛋白酶成分，起到中和作用。这种作用是偶然发现的，现在则有目的的使用血清来终止胰蛋白酶的消化作用。因为胰蛋白酶已经被广泛用于贴壁细胞的消化传代。血清蛋白形成了血清的粘度，可以保护细胞免受机械损伤，特别是在悬浮培养搅拌时，粘度起到重要作用。血清还含有一些微量元素和离子，他们在代谢解毒中起重要作用，如SeO3,硒等。
血清培养基主要问题
1．血清的成份可能有几百种之多，目前对其准确的成份、含量及其作用机制仍不清楚，尤其是对其中一些多肽类生长因子、激素和脂类等尚未充分认识，这给研究工作带来许多困难。
2．血清都是批量生产，各批量之间差异很大，而且血清保存期至多一年，因此，要保证每批血清的相似性极为困难，从而使实验的标准化和连续性受到限制。
3．对大多数细胞，在体内状态，血清不是它们接触的生理学液体，只是在损伤愈合以及血液凝固过程中才接触血清，因此使用血清有可能改变某种细胞在体内的正常状态，血清可能促进某些细胞的生长（成纤维细胞）同时抑制另一类细胞生长（表皮细胞）。
4．血清含一些对细胞产生毒性的物质，如多胺氧化酶，能与来自高度繁殖细胞的多胺反应（如精胺、亚精胺）形成有细胞毒性作用的聚精胺。补体、抗体、细菌毒素等都会影响细胞生长，甚至造成细胞死亡。
5．动物个体不同，血清产地、批号不同，每批质量差异甚大，其成分不能保持一致。
6．取材中可能带入支原体、病毒，对细胞产生潜在影响，可能导致实验失败或实验结果不可靠性。
7．大规模生产中，血清来源越来越困难，价格昂贵，是构成动物细胞培养对生产成本的主要部分之一。
血清的质量标准
血清质量高低取决于两方面因素：一是取材对象，二是取材过程。用于取材的动物应健康无病并且在指定的出生天数之内，取材过程应严格按照操作规程执行，制备出的血清要经过严格的质量鉴定。WHO公布的《用动物细胞体外培养生产生物制品规程》中的要求：
1．牛血清必须来自有文件证明无牛海绵状脑病的牛群或国家。并应具备适当的监测系统。
2．有些国家还要求牛血清来自未用过反刍动物蛋白饲料的牛群。
3．证明所用牛血清中不含对所生产疫苗病毒的抑制物。
4．血清要通过滤膜过滤除菌，保证无菌。
5．无细菌、霉菌、支原体和病毒的污染，有些国家要求无细菌噬菌体污染。
6．对细胞有良好的支持繁殖作用。
我国在对牛血清的质量2000年版《中国生物制品主要原辅料质控标准》中提出比较严格的标准要求。包括蛋白质含量，细菌、真菌、支原体、牛病毒、大肠杆菌噬菌体、细菌内毒素，支持细胞增殖检查。

外周血培养基配制
一、配制用水
培养基的大部分是水，所以水的质量直接影响培养基的质量。按Waymouth标准，水的电阻应为200万奥姆，一般实验室里以玻璃蒸馏器制备的
双蒸水或三蒸水可以符合使用条件。
二、培养基
培养基有天然、人工两种。一般实验室使用的是RPMI-1640粉末培养基，以双蒸或三蒸水配制。NaHCO3（或HCl）调pH至7.2～7.4，若pH值超
过7.6或远低于6.8，则大多数细胞不能生长。RPMI-1640不耐高压灭菌，使用前需经灭菌0.22μm孔径滤膜滤过处理。
三、血清
培养中常使用小牛血清（或胎牛血清）。血清亦不能高压灭菌，无菌的小牛血清需在56℃水浴30分钟灭活补体，置4℃冰箱存放待用。配制时含
量视培养细胞种类、时间而定，一般用10—15%。由于血清成分复杂、条件不易控制，可选用无血清培养基。
四、抗菌素
为防止培养时期细菌的污染，可在培养基中添加适当抗菌素，一般用量与组织细胞培养相同：卡那霉素100单位/毫升，或双抗--青霉素100单位/
毫升，链霉素100微克/毫升。
五、植物血凝素（PHA）
非增殖期的细胞不能制备染色体，如人外周血淋巴细胞，但在离体培养过程中，在PHA的作用下，可被刺激转化为淋巴母细胞而进入有丝分裂。
经实验测定其分裂高峰分别于培养后44—48小时和68—72小时。
PHA有粘多糖，蛋白质两种重要成分。粘多糖促使有丝分裂，蛋白质起凝集作用。PHA激活的细胞数随其浓度而增加，直至全部免疫活性细胞均
被激活为止，但PHA浓度过高会引起凝集，一般采用4%浓度为好。

7、知道人骨髓瘤细胞U266具体培养的信息吗

U266细胞；人骨髓瘤细胞以培养瓶包装，容积为75毫升，细胞数量达10的6次方，用专用防压泡沫盒包装，内层无菌自封袋，外层防压保温气泡袋。使用者在接收、处理、保存、丢弃、转让及使用细胞的时候要遵守国内外有关的法律法规。

1) 细胞抗体荧光免疫方法验证:
每管含有细胞数>1x106 cells/ml，经测试不含有HIV-1、HBV、HCV、支原体、细菌、酵母和真菌。密度超过90%，品牌认证，我们现货供应细胞株、细胞系多达4000多种产品，您可放心采购。
2) 用大量次培养基做培养:
来自sciencell、ICLC、ATCC等细胞库，从胚胎提取，于原代（或二代）冻存在液氮中，一律版采用干冰运输。客户收到细胞后，从干冰中取出放入液氮中保存，待实验安排好后，解冻后即可以进行复苏培养。
U266细胞；人骨髓瘤细胞采用干冰保存运输。收到细胞时，若干冰已经完全融化，请立即将细胞复苏培养；若尚留有干冰，请立即将细胞放入液氮中保存待用，请按指定条件贮存细胞，切不可将细胞置于高温环境。权

8、培养基的常见培养基

牛肉膏琼脂培养基
牛肉膏0.3g ，蛋白胨1.0g，氯化钠0.5g，琼脂1.5g，水100ml
在烧杯内加水100ml，放入牛肉膏、蛋白胨和氯化钠，用蜡笔在烧杯外作上记号后，放在火上加热。待烧杯内各组分溶解后，加入琼脂，不断搅拌以免粘底。等琼脂完全溶解后补足失水，用10%盐酸或10%的氢氧化钠调整pH值到7.2-7.6，分装在各个试管里，加棉花塞，用高压蒸汽灭菌：1.05千克每平方厘米、121摄氏度维持15-30分钟。
牛心培养基
取新鲜牛心（除去脂肪和血管）250克，用刀细细剁成肉末后，加入500毫升蒸馏水和5克蛋白胨。在烧杯上做好记号，煮沸，转用文火炖2小时。过滤，滤出的肉末干燥处理，滤液pH值调到7.5左右。每支试管内加入10毫升肉汤和少量碎末状的干牛心，灭菌，备用。
根瘤菌培养基
葡萄糖10g，磷酸氢二钾0.5g，碳酸钙3g，硫酸镁0.2g，酵母粉0.4琼脂20g，水1000ml，1%结晶紫溶液1ml。
先把琼脂加水煮沸溶解，然后分别加入其他组分，搅拌使溶解后，分装，灭菌，备用。 淀粉硝酸盐培养基（高氏一号培养基）
可溶性淀粉2.0g，硝酸钾0.1g，磷酸氢二钾0.05g，氯化钠0.05g，硫酸镁0.05g，硫酸亚铁0.001g，琼脂2g，水100ml。
先把淀粉放在烧杯里，用5ml水调成糊状后，倒入95ml水，搅匀后加入其他药品，使它溶解。在烧杯外做好记号，加热到煮沸时加入琼脂，不停搅拌，待琼脂完全溶解后，补足失水。调整pH值到7.2-7.4，分装后灭菌，备用。
面粉琼脂培养基
面粉60g，琼脂20g，水1000ml
把面粉用水调成糊状，加水到500ml，放在文火上煮30分钟。另取500ml水，放入琼脂，加热煮沸到溶解后，把两液调匀，补充水分，调整pH值到7.4，分装，灭菌，备用。 BG-11培养基
NaNO3 1.5g，K2HPO4 ·3H2O0.04g，MgSO4·7H2O0.075g，CaCl2 ·2H2O0.036g Citric Acid （柠檬酸 ）0.006g，Ferric ammonium citrate（柠檬酸铁铵0.006g，EDTA (dinatrium-salt) 0.001g，Na2CO3 0.02g，A5 + Co solution * （A5溶液1000×）1ml Distilled Water （蒸馏水）919ml
SE培养基 NaNO3 0.25g K2HPO4 . 3H2O 0.075g MgSO4 . 7H2O 0.075g CaCl2 . 2H2O 0.025g KH2PO4 0.175g NaCl 0.025 Soil extract 40ml FeCl3·6H2O 0.005 Fe—EDTA 1ml A5 solution 1000× 1ml distilled water 958ml Soil Extract(土壤提取液)配置方法
取花园土未施过肥0.5kg置于烧杯或三角瓶中，加入蒸馏水1000毫升，瓶口用透气塞封口，在水浴中沸水加热2小时，冷却数小时，在无菌条件下过滤，取上清液，将灭菌蒸馏水加入上清液至总体积1000毫升。土壤提取液保存在4ºC备用。
Composition of the A5 solution
Add to 100 ml of distilled water:（加入100ml 的蒸馏水） H3BO3 286 mg MnCl2 . 4H2O 181 mg ZnSO4 . 7H2O 22 mg CuSO4 . 5 H2O 7.9 mg (NH4）6Mo7O24 .4H2O 3.9 mg EDTA-Fe的配置方法：
将EDTA和FeCl3·6H2O分别溶于水和HCl(0.1N)，混匀即可。 Na2EDTA 1g distilled water 50ml FeCl3·6H2O 81 mg HCl（0.1N） 50ml Pr培养基
Preparation: to 997 mL of glass-distilled water, add 1.0 g proteose peptone, 15.0 g agar, and the following stock solutions: working solution g/1000 mL H2O NaNO3 0.25 CaCl2. 2H2O 0.025 MgSO4. 7H2O 0.075 K2HPO4 0.075 KH2PO4 0.175 NaCl 0.025 A5 solution 1ml EDTA-Fe 1ml FeCl3 (0.05%) 1ml A5溶液和EDTA-Fe溶液配制方法同上。 萨市（Sabouraud’s）培养基
蛋白胨10g，琼脂20g，麦芽糖40g，水1000ml
先把蛋白胨、琼脂加水后，加热，不断搅拌，待琼脂溶解后，加入40g麦芽糖（或葡萄糖），搅拌，使它溶解，然后分装，灭菌，备用。
本培养菌是培养许多种类真菌所常用的。
马铃薯糖琼脂培养基
把马铃薯洗净去皮，取200g切成小块，加水1000ml，煮沸半小时后，补足水分。在滤液中加入10g琼脂，煮沸溶解后加糖20g（用于培养霉菌的加入蔗糖，用于培养酵母菌的加入葡萄糖），补足水分，分装，灭菌，备用。
把这培养基的pH值调到7.2-7.4，配方中的糖，如用葡萄糖还可用来培养放线菌和芽孢杆菌。
豆芽汁培养基
黄豆芽100g，琼脂15g，葡萄糖20g，水1000ml
洗净黄豆芽，加水煮沸30分钟。用纱布过滤，滤液中加入琼脂，加热溶解后放入糖，搅拌使它溶解，补足水分到1000ml，分装，灭菌，备用。
把这培养基的pH值调到7.2-7.4，可用来培养细菌和放线菌。
豌豆琼脂培养基
豌豆80粒，琼脂5g，水200ml
取80粒干豌豆加水，煮沸1小时，用纱布过滤后，在滤液中加入琼脂，煮沸到溶解，分装，灭菌，备用。 马铃薯-蔗糖-琼脂培养基
20%马铃薯煮汁1000ml，蔗糖20g，琼脂18g
把马铃薯洗净去皮后，切成小块。称取马铃薯小块200g，加水1000ml，煮沸20分钟后，过滤。在滤汁中补足水分到1000ml，即成20%马铃薯煮汁。在马铃薯煮汁中加入琼脂和蔗糖，煮沸，使它溶解后，补足水分，分装，灭菌，备用。使用该培养基对pH值要求不严格，可以不测定。
综合马铃薯培养基
20%马铃薯煮汁1000ml，磷酸二氢钾3g，硫酸镁1.5g，葡萄糖20g，维生素10mg，琼脂18g
先配制20%马铃薯煮汁，方法同上。在煮汁中加入上述各种组分，加热溶解后补足水分，调整pH值到6。分装，灭菌，备用。 该培养基用于培养和保存灵芝、平菇、香菇等食用菌菌种。 在植物组织培养时，通过调节IAA和CTK的比值能影响愈伤组织分化出根或芽。CTK/IAA高时，愈伤组织分化芽。
CTK/IAA低时，分化根；CTK/IAA比例适中维持愈伤组织不分化。
愈伤组织诱导培养基制备
以MS培养基母液为基础，向洁净铝锅中顺序加入大量元素20×母液100mL,微量元素100×母液20mL,铁盐100×母液20mL ，维生素100×母液20mL，肌醇200×母液10mL,甘氨酸200×母液10mL，配制得MS培养基后，再加入0.5mg·L-1的BA8mL，0.5mg·L-1的NAA8mL。然后加入实际配制培养基体积约2/3-3/4的蒸馏水，加入40g蔗糖后搅拌使其溶化，用0.5mol·L-1的NaOH和0.5 mol·L-1的HCl调整pH值至5.8-6.0。加入14g琼脂，将铝锅置于电炉上,搅拌加热使琼脂完全溶化，然后用蒸馏水定容至终体积2L，继续加热几分钟使之混合均匀后分装于三角瓶中。
烟草叶片愈伤组织诱导取一无菌培养皿，用解剖刀切取1-2片无菌苗叶片置于无菌培养皿中，并用解剖刀将叶片切成2mm2左右的小片，然后将其接种于准备好的培养基上，每瓶接种5小片，一共接种6瓶。接种后的三角平置于24条件下黑暗培养1周，然后在同样温度下有光照和全黑暗下培养3周直至愈伤组织形成(两种情况各置3瓶)。观察愈伤组织诱导结果，统计愈伤组织诱导率。
器官分化及植株再生培养
将诱导的愈伤组织按类型分别转入分化培养基上,置于连续光照，温度20-22℃条件下培养3周，统计愈伤组织再生植株情况。
愈伤组织诱导的总体情况
烟草愈伤组织诱导培养4周后，愈伤组织基本形成，即排除因生长时间不够而未形成愈伤的情况。具体情况见表一中所示。6瓶培养物均有愈伤形成，且都未发生污染，但诱导率几乎各不相同。其中， 在光照条件下培养的3瓶平均愈伤诱导率为60.0℅，在黑暗条件下培养的3瓶平均愈伤诱导率为46.7%。由于实验过程中，外植体即烟草叶片取得偏小，接种时可能已有部分外植体的大部分细胞脱水死亡，使整个实验的愈伤组织诱导率偏低,愈伤块偏小。 RPMI1640培养基是一个全营养型培养基，广泛应用于哺乳动物细胞和杂交瘤细胞的培养，如人骨髓瘤细胞、鼠杂交瘤细胞、人白细胞以及B细胞和T细胞。最初设计用于悬浮细胞培养和人白血病细胞的单层细胞培养。

9、培养肿瘤细胞用什么培养基

肿瘤细胞最好培养了，M199，RPMI-1640，DMEM都可以。我常用的是1640.