1、为何基因敲除需要用到嵌合体小鼠
嵌合体是指动物的两颗受精卵融合在一起成为一个个体并成长。遗传学上用以指不同遗传性状嵌合或混杂表现的个体，亦指染色体异常类型之一。转基因小鼠制备过程中必须要经历的一个过程，所以基因敲除小鼠必须要用到嵌合体小鼠。
2、如何高效制备生殖系传递的嵌合体小鼠
嵌合体是指动物的两颗受精卵融合在一起成为一个个体并成长。遗传学上用以指不同遗传性状嵌合或混杂表现的个体，亦指染色体异常类型之一。转基因小鼠制备过程中必须要经历的一个过程，所以基因敲除小鼠必须要用到嵌合体小鼠。A和B都不会相互排斥,由于在胚胎期间免疫系统发生了一种称为免疫耐受的机制,对对方的MHC抗原发生了耐受,所以双方的免疫系统对另一方的抗原处于默认“放行”的状态；器官移植时候,没有这种免疫耐受的机制,只能通过化学药物进行抑制免疫系统的方法减缓排异反应.具体可以百度“免疫耐受”、“MHC”、“HLA”等抗原.
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4、如何设计条件性基因敲除小鼠模型
小鼠和大鼠可谓是生命科学实验室里的明星,成功的小鼠和大鼠模型可谓是生命科学的好帮手.很多人可能想自己设计或是了解条件性基因敲除小鼠,在此做个小结,供大家参考.
条件性基因敲除小鼠的设计利用了Cre/LoxP或Flipe/Frt原理.它们都是位点特异性重组酶系统.这里以Cre/LoxP系统为例.比如在待敲除的一段目标DNA序列的两端各放置一个loxP序列,得到flox(flanked by loxP)小鼠.将flox小鼠与带有细胞特异性表达Cre的小鼠交配繁殖,以获得在特定细胞里把目标基因敲除掉的小鼠,即条件性基因敲除小鼠.此外,若与控制Cre表达的其他诱导系统(比如CreERT2)相结合,还可以对某一基因同时实现时空两方面的调控.
Cre/loxP系统来源于噬菌体,可以介导位点特异的DNA重组.该系统含有两个组成成分：一个是一段长34bp的DNA序列(LoxP序列),含有两个13 bp的反向重复序列和一个8 bp的核心序列.LoxP的方向由中间这8个碱基决定.这段LoxP序列是Cre重组酶识别的位点.令一个组成部分是Cre重组酶.它是由噬菌体编码的一种由343个氨基酸组成的蛋白.Cre可以介导两个LoxP位点的重组,从而引起两个LoxP之间DNA序列的缺失.如果将Cre重组酶cDNA通过基因工程的手段置于组织或细胞特异性启动子之下,可以得到Cre组织/细胞特异性表达的Cre小鼠,也叫Cre工具小鼠.跟Flox小鼠交配之后,可以得到条件性基因敲除小鼠.
所谓Flox小鼠是指在某个基因的某个外显子两侧各放一个LoxP序列.这段序列就是Flanked by LoxP,也就叫做Flox小鼠.这种Flox小鼠一般要通过设计构建打靶载体、胚胎干细胞重组、囊胚显微注射、和嵌合体小鼠传代来获得.这种小鼠跟Cre工具小鼠交配,由于Cre的表达,介导两个LoxP位点序列的重组,从而敲除两个LoxP之间的序列.由于不同Cre工具小鼠的Cre表达有组织/细胞特异性,就可以达到在不同组织、细胞里特异性敲除目的基因的目标.比如上皮细胞、胸腺细胞、T细胞、B细胞、心肌细胞、肠道、肺脏等.
那如何设计条件性基因敲除小鼠呢?这里所说的设计主要是Flox小鼠的设计.所谓条件性敲除,是说除了特定细胞外,其它细胞里面没有任何的基因表达异常.一般情况下,不要在第一个外显子前面放置LoxP序列.因为第一个外显子前面一般是启动子.放置LoxP序列有可能会破坏或改变启动子活性.条件性敲除一般是敲掉最早引起移码突变的外显子.这样的话,最好不要敲除有起始密码子ATG的外显子.否则的话,基因可能会利用ORF内的ATG编码一个缺少部分N端序列的蛋白,这个蛋白很可能有全部或部分野生蛋白的功能.在选择要敲除的外显子的时候(各放一个LoxP在一个外显子的两侧),该外显子的碱基数目不能是3N,否则新基因pre-RNA拼接得到的mRNA不能产生移码突变.会产生一个与野生蛋白相比少了一段中间序列的新蛋白.如果一个外显子的碱基数目是3N+1或3N+2,敲除这个外显子之后会产生移码突变,就可以达到基因敲除的目的.筛选要敲除(Floxed)的外显子的时候,一般是从最上游的外显子开始筛选适合敲除的外显子.需要注意的是,一般的dna分析软件不能确定内含子和外显子的边界,需要仔细核对.95%以上的边界遵循gt/ag边界原则.也可以在Ensembl上查一个基因的外显子和内含子.这个网站上的结果绝大部分是正确的.但也需要仔细核对.毕竟基因敲除小鼠研发是一个时间比较长的过程,需要特别小心.前期做多少的考虑都不嫌多.这些原则只是对一般课题的考虑.特殊情况需要特殊处理.
5、嵌合体小鼠的免疫系统问题
A和B都不会相互排斥， 由于在胚胎期间免疫系统发生了一种称为免疫耐受的机制，对对方的MHC抗原发生了耐受，所以双方的免疫系统对另一方的抗原处于默认“放行”的状态；器官移植时候，没有这种免疫耐受的机制，只能通过化学药物进行抑制免疫系统的方法减缓排异反应。具体可以百度“免疫耐受”、“MHC”、“HLA”等抗原。谢谢！
6、（2014?南平模拟）科学家从129品系小鼠中成功分离出胚胎干细胞，并注入小鼠的囊胚，形成嵌合体囊胚，育出
（1）在基因工程中，病毒常被用作运载体，可知携带GFP基因的病毒是导入目的基因的运载体，即作为基因表达载体．
（2）GFP基因能表达出绿色荧光蛋白，步骤②中，利用荧光显微镜发出绿色荧光观察到稳定高效表达GFP的胚胎干细胞，将其取出，进行扩增培养．
（3）步骤③中，将胚胎从子宫或输卵管中冲出，这种胚胎的收集方法称为冲卵．
（4）步骤⑤中，嵌合体囊胚发育成表达GFP的小鼠，此过程胚胎干细胞可以分化形成包括生殖腺在内的各种组织．
（5）表达GFP的嵌合体小鼠和小鼠经过杂交育种，获得子代小鼠，在经过筛选可获得表达绿色荧光蛋白（ GFP）转基因昆明（KM）小鼠，图中X小鼠为KM小鼠．
故答案为：
（1）基因表达载体
（2）发出绿色荧光
（3）冲卵
（4）分化
（5）KM
7、小鼠敲除基因之后出生致死 有哪些原因
基因敲除鼠技术是上世纪80年代中后期基于DNA同源重组的原理发展起来的，Capecchi和Smithies在1987年根据同源重组（homologous recombination）的原理，首次实现了ES的外源基因的定点整合（targeted integration），这一技术称为"基因打靶"（gene targeting）或"基因敲除"（gene knockout），利用这种ES的显微注射就可以制作出基因敲出小鼠（KO Mice: knockout mice）;由于这一工作，Capecchi和Smithies于2007年与Evans分享了诺贝尔医学奖。
同源重组（homologous recombination）定义：是指发生在姐妹染色单体（sister chromatin) 之间或同一染色体上含有同源序列的DNA分子之间或分子之内的重新组合。在基因敲除小鼠制作过程中，需要针对目的基因两端特异性片段设计带有相同片段的重组载体，将重组载体导入到胚胎干细胞后外源的重组载体与胚胎干细胞中相同的片段会发生同源重组，如图1所示：
图1.基因敲除鼠制作同源重组原理示意图
制作流程
基因敲除小鼠技术专题
图2.基因敲除鼠制作过程示意图
1、Knockout载体设计与构建
根据研究项目具体情况和要求把目的基因和与细胞内靶基因特异片段同源的DNA 片段都重组到带有标记基因(如neo 基因，TK 基因等)的载体上，成为重组的Knockout载体。
2、Knockout ES细胞筛选
Knockout载体测序验证正确后，将载体线性化，然后电转入ES细胞，通过载体上的正负筛选基因获得阳性的Knockout ES克隆。选取PCR鉴定打靶载体正确插入的ES基因组DNA用于Southern Blot鉴定，将Southern Blot鉴定的Knockout ES扩大培养并液氮保存。
3、Knockout ES细胞囊胚注射得到嵌合体小鼠
扩增经鉴定插入或置换片段位置正确的Knockout ES细胞，以囊胚显微注射的方式将一定数量的Knockout ES细胞注入特定品系小鼠囊胚中，然后将囊胚移植到假孕的小鼠子宫中。待后代小鼠出生后，通过小鼠的毛色中来源于ES细胞毛色的比例判断嵌合程度的高低，以及该小鼠的后代中可能获得生殖系传递能力。
4、由嵌合体小鼠繁殖出生殖遗传系Knockout 小鼠
将嵌合体小鼠与适当品系的小鼠交配，后代小鼠出生后，通过PCR方式检测小鼠是否含有打靶序列。如有，则该小鼠为具备生殖遗传能力的Knockout小鼠(F1代鼠)。
5、Knockout小鼠生殖系传递鉴定
将嵌合体小鼠和适当品系野生型小鼠交配，通过后代小鼠毛色或PCR基因型鉴定的方法验证嵌合体小鼠生殖系传递能力。
基因敲除常见方法
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一、常规基因敲除鼠（Conventional Knockout）
常规基因敲除是通过基因打靶，把需要敲除的基因的几个重要的外显子或者功能区域用Neo Cassette 替换掉。这样的小鼠其全身所有的组织和细胞中都不表达该基因产物。此类基因敲除鼠一般用于研究某个基因在对小鼠全身生理病理的影响，而且这个基因没有胚胎致死性。
二、条件性基因敲除小鼠（Conditional Knockout）
条件性基因敲除小鼠是通过基因打靶，把两个loxP位点放到目的基因一个或几个重要的外显子的两边。该小鼠和表达Cre酶小鼠杂交之前，其目的基因表达完全正常。当和组织特异性表达Cre酶的小鼠进行杂交后，可以在特定的组织或细胞中敲除该基因，而该基因在其他组织或细胞表达正常。
条件性基因敲除鼠适用范围为：（1）该基因有胚胎致死性；（2）用于研究该基因在特定的组织或细胞中的生理病理功能。
三、基因敲入小鼠（Knockin）
基因敲入小鼠是通过基因打靶，把目的基因序列敲入到小鼠的相应基因位点，使用小鼠的表达调控元件指导目的基因表达。
此类基因敲入鼠一般用于药物的筛选，信号通路的研究等。
获得嵌合体及之后品系纯化详细流程:
基因敲除其他方法
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一、ZFN技术制作基因敲除鼠
ZFN能够识别并结合指定的基因序列位点，并高效精确地切断。随后细胞利用天然的DNA修复过程来实现DNA的插入、删除和修改，这样研究人员就能够随心所欲地进行基因组编辑。这在过去是无法想象的，传统的基因敲除技术依赖细胞内自然发生的同源重组，其效率只有百万分之一，而ZFN的基因敲除效率能达到10%。利用这些技术进行小鼠基因的定点敲除和敲入，可以把时间从一年缩短到几个月。
这项技术中设计特异性的ZFN是最关键的环节，目前研究者采用计算生物学方法设计高特异性的ZFN，但ZFN的脱靶（off target），也就是把不该切的地方切了的问题仍是一个挑战。也正因为这个原因，利用ZFN技术进行小鼠的基因修饰还无法完全取代传统技术。
二、TALEN技术制作基因敲除鼠
TALEN 技术是一种崭新的分子生物学工具。科学家发现，来自一种植物细菌的TAL蛋白的核酸结合域的氨基酸序列与其靶位点的核酸序列有恒定的对应关系。利用TAL的序列模块，可组装成特异结合任意DNA序列的模块化蛋白，从而达到靶向操作内源性基因的目的，它克服了ZFN方法不能识别任意目标基因序列，以及识别序列经常受上下游序列影响等问题，而具有ZFN相等或更好的灵活性，使基因操作变得更加简单方便。然而同样因为脱靶的问题，利用TALEN技术进行小鼠的基因修饰仍然无法取代传统技术。
常见问题与解答
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一、什么是ES细胞显微注射？
答：胚胎干细胞显微注射是制作基因敲除小鼠的一个最常用的方法。主要过程是将携带目的基因的胚胎干细胞注射到小鼠的囊胚腔中获得嵌合体小鼠。所得嵌合体小鼠的组织，将同时含有来源于囊胚的细胞和胚胎干细胞。嵌合体小鼠必须和野生型小鼠配种以决定遗传改变的生殖系能否传递，这样可能获得转基因或打靶基因（来源于胚胎干细胞）稳定的生殖系传递的小鼠。一般情况下，大约能获得50%继承了目的基因的后代。
二、嵌合体
遗传学上用以指不同遗传性状嵌合或混杂表现的个体。免疫学上的涵义则指一个机体身上有两种或两种以上染色体组成不同的细胞系同时存在,彼此能够耐受,不产生排斥反应,相互间处在嵌合状态。在基因敲除鼠中指通过向囊胚注射被外源基因转化了的胚胎干细胞，使得发育成为的个体中含有不同基因型的细胞，产生的个体也叫嵌合体，即该生物体中嵌合了两种不同遗传结构的细胞（一种是基因型被改变了的细胞，另一种是原来的基因型的细胞）。
三、条件性敲除的原理？
答：Cre-LoxP系统是源于P1噬菌体的一个DNA重组体系,由Cre酶和相应的LoxP位点组成,它能导致重组发生在特定的DNA序列处(LoxP位点),该系统可以将外源基因定点整合到染色体上或将特定DNA片段删除。基于Cre-LoxP的基因打靶要分两步来进行。首先要在胚胎干细胞的基因组中引入LoxP序列，这一步可以通过打靶载体的设计和对同源重组子的筛选来实现。下一步通过Cre介导的重组来实现靶基因的遗传修饰或改变。Cre-LoxP系统既可以在细胞水平上用Cre重组酶表达质粒转染中靶细胞，通过识别LoxP位点将抗性标记基因切除，又可以在个体水平上将重组杂合子小鼠与Cre转基因小鼠杂交，筛选子代小鼠就可得到删除外源标记基因的条件性敲除小鼠。
四、如何鉴定和挑选嵌合体？
答：动物只有部分组织细胞整合有外源基因，则称为嵌合体动物。它的鉴定主要根据毛色去鉴定。注射的ES和囊胚来源不同的小鼠品系。它们的毛色不同。因此可以根据毛色的嵌合率来鉴定和挑选嵌合体。
五、ROSA26与定点插入？
答：利用同源重组技术，把外面的cDNA片段或者其他DNA片段，定点插入到ROSA26位置。ROSA26是一个安全区域，外源性的基因定点插入这个位点不会影响其他基因的表达。
8、基因敲除小鼠 是什么意思？
“基因敲除小鼠”，就是先在小鼠的胚胎干细胞上通过基因重组的办法进行基因修饰——就是将胚胎干细胞中的靶向基因改掉，然后将“修饰”后的胚胎干细胞植入小鼠的早期胚胎，生成嵌合体小鼠。这种嵌合体小鼠长大后，体内同时存在被“修饰”过的基因和未被“修饰”的基因。如果某些小鼠的生殖细胞恰巧被“修饰”过了，则它们就会生出基因完全被“修饰”过的小鼠。
这种方法本身就是生物医学领域里一项极具开创性的方法，同时，由于人类基因与小鼠基因有90％以上的相似性，因此它在理论上具备了用于心脏病、糖尿病等人类遗传因素引发的疾病研究的可能。