1、骨髓干细胞的分离
骨髓抽取及骨髓干细胞的分离纯化：患者在无菌条件下从髂后上棘进行穿刺，分不同部位抽取骨髓l0～20 mL，置于肝素化的无菌离心管中，骨髓离心取出脂肪层
2、直接分离人中性粒细胞做实验效果好不好
小鼠骨髓中性粒细胞的分离
实验器材：器械（眼科小直剪2把，小弯镊3把），无菌塑料滴管，15ml离心管，4mlEP管，培养皿，1ml器，70um尼龙筛网，低温离心机 试剂：PBS（1×，10×），HBSS，percoll，percoll储存液（percoll:10×PBS=9:1），percoll溶液（45%，81%，62%，55%，50%，分别用1×PBS稀释Percoll储存液到相应浓度）Histopaque1119，小鼠中性粒细胞缓冲液（MNB，既含0.1%牛血清白蛋白，1%葡萄糖的HBSS溶液）
材料：8-12周C57小鼠 实验步骤：
拉颈处死小鼠，分离其胫骨和股骨，用纱布将胫骨和股骨擦干净，置于75%酒精中浸泡5min
2.用小直剪剪掉骨髓两端，暴露骨髓腔，用MNB冲洗，每次1ml，胫骨冲洗两次，股骨冲洗3次。
3.冲洗液用70um尼龙筛网过滤，离心收集细胞，600g 4℃ 10min,低减速。 4.弃上清，用3ml45%percoll溶液重悬细胞
5.Percoll梯度准备：3ml81%，2ml62%，2ml55%，2ml50%percoll溶液 6.小心的将细胞悬液置于percoll梯度上，1600g,30min,10℃,无制动离心。 7.弃掉62%percoll层以上的溶液，收集62%-81%之间的percoll层。
8.10mlMNB洗两次，600g,10℃,10min,离心。弃上清，用3mlMNB重悬细胞。
9.将细胞悬液小心得置于3mlHistopaque1119上，1600g,10℃,30min,无制动离心，去除红细胞层。
10.收集1119和MNB之间的细胞层，10mlMNB 洗两次，600g, 4℃ 10min,低减速离心 11.按需要将细胞用培养基重悬到一定的浓度。
3、跪谢先，我要收集骨髓液，分离单核细胞提取DNA和RNA。应该怎样保存骨髓液呢
一般生物样品都是放在-80冰箱保存，不过如果是蛋白的话，-80冰箱保存两个月也会降解！RNA时间久更短了。
融化时，打一盒冰 ，样品放在冰上溶解。
运输条件一般有两种，一种是放冰袋到泡沫盒中，另一种就是放干冰到泡沫盒中，
4、骨髓间充质干细胞分离的方法有几种
目前常用的分离MSC的方法主要有全骨髓法和密度梯度离心法，全骨髓法即根据干细胞在低血清培养基中有贴壁优势特性，定期换液除去不贴壁细胞，从而达到纯化及扩增MSC的目的。密度梯度离心法即根据骨髓中各细胞成分比重的不同，分离单核细胞进行贴壁培养。二者本质上无多大区别。随着对MSC表面抗原认识的深入，又有人利用免疫方法如流式细胞仪法、免疫磁珠法等对其进行分离纯化。但经过流式或磁珠分选后的细胞出现了增殖缓慢等一些问题，加之成本较高和技术的难度，在某种程度上限制了这些方法的广泛应用。
5、各位大侠，naive T 细胞的分离
GVHD是同种异体造血干细胞移植(allo-HSCT)后影响预后的 重要并发症。受者预处理造成组织损伤并释放炎性因子(如IFN-γ、IL-2等)引 起GVHD。最近的研究发现骨髓来源的间充质干细胞(MSCs)不仅可以分化为 多种间充质组织，而且具有支持造血和免疫调节作用，但其机制尚不清楚。目前 的研究认为供者来源的Naive T细胞识别受者主要组织相容性抗原启动了 GVHD。我们将体外新生的Naive T细胞接种于异基因MSCs上，观察MSCs对 Naive T细胞分泌细胞因子的影响，直接研究它对Naive T细胞的作用，将更深入 地揭示其预防GVHD的机制。 材料和方法：
1、 MSCs体外分离培养：将肝素抗凝的骨髓用密度梯度离心 法(过percoll细胞分离液)分离出单个核细胞，体外培养贴壁细胞，传3代后得 到纯度和数量均较高的MSCs，经60Co照射后作为实验细胞。
2、 脐血CD34+细 胞体外分化为Naive T细胞：将胎儿胸腺组织贴壁培养建立胸腺基质细胞培养 (TSC)体系；用单克隆抗体-磁珠分离系统分离纯化脐血CD34+细胞；将CD34+ 细胞植入TSC并添加IL-12、 FL、IL-2，共孵育5周后获取Naive T细胞并通过 流式细胞术鉴定其表型。
3、 MSCs与Naive T细胞共孵育：将体外培养获取的 Naive T细胞种入经照射近融合的MSCs中，对照组为单独MSCs培养和单独Naive T细胞培养。孵育7天后，取上清用ELISA定量检测IL-2、 IFN-γ、IL-4和IL-10， 并应用流式细胞仪检测共孵育前后T淋巴细胞表型变化 结果：1、 人骨髓来源的MSCs可以在体外培养扩增，用流式细胞术分析传3 代以后的细胞发现它们具有共同的表型CD166+，CD105+， CD45-和CD34-，2、 CD34+细胞可在TSC体系中分化出Naive T细胞，随着培养时间的延长，与体内 胸腺生成T细胞类似，依次出现CD4／8双阴性，双阳性，单阳性细胞。培养第5 周细胞表型测定：CD4+65． 2％，CD8+52． 7％，CD3+78． 8％，CD45RA表达88． 9％。3、 中文摘要 MSCS与NaiveT细胞共孵育七天，镜下观察可见共孵育组T细胞数量轻度增加， 流式细胞仪检测共孵育前后T淋巴细胞表型显示CDS+细胞相对增加。ELISA检 测上清发现共孵育组IFN一Y分泌减少(p0 .05)，IL一2分泌增加(p0.05)。另 外，在实验组和对照组中均未检测到IL一4、IL一10。 结论:MSCs具有一定的异基因反应性，能刺激NaiveT细胞增生，且MSCs 和NaiveT细胞共孵育组上清中的IL一2分泌增加而IFN一Y分泌减少，提示MSCs 可能借CDS+调节T细胞增生抑制异基因反应性T细胞分泌IFN一Y来发挥免疫调 节作用，本文结果将为进一步阐明MSCs免疫调节机制提供新的线索。
6、骨髓单个核细胞分离，目的用于RNA的提取
用淋巴细胞分离液就可以了。天津生产的，90元一瓶，200毫升。
1 骨髓液3毫升，用3毫升PBS稀释混匀；
2 平铺于6毫升淋巴细胞分离液液面上，保持界面清晰；
3 2000转/分水平离心30分钟；
4 1毫升针头吸取中间云雾层；
5 用PBS洗涤两次。
骨髓液用抗凝管收集就可以了，不要放到4度冰箱，避免溶血；淋巴细胞分离液使用前室温平衡；离心机必须为水平离心，不要突然刹车，应使速度缓慢下降；骨髓液和淋巴细胞分离液必须保持界面清晰。
7、外周血细胞分离的方法有哪些？分别如何操作
外周血中除红细胞外，还有粒细胞、单核细胞和淋巴细胞及血小板等，通常是分离这些血细胞的重要来源。其分离方法有四种：自然沉降法、差异沉降法、氯化铵分 离法、Ficoll分离法。
1、自然沉降法：
将无菌抗凝血放入试管中，在37℃水浴中静置，自然沉降1-2h，可见到红细胞下沉，并有明显分层，上层血浆中富含有大量的 和淋巴细胞，下层主 要为红细胞。此方法简便但各层中的细胞种类多，不纯。血浆中虽以粒细胞、淋巴细胞为主，但也含有血小板，大单核细胞和少量红细胞。下层虽以红细胞为主，但 也有上述各种细胞，此法适用于淋巴细胞转化试验。
2、差异沉降法：
用6%的右旋糖酐或3%的明胶溶液无菌消毒后，分装于中试管中，由于这些物质能使红细胞形成“串状”，比粒细胞、淋巴细胞沉降速度快，因而可使红细胞与白细胞、淋巴细 胞分离开。其方法如下：用6%的右旋糖酐溶液5-10ml，经抗凝血5ml加入上层中混合后静置于37℃水浴中30-60min，即可见红细胞下沉，上层富含大量粒细胞和淋巴细胞，下层为红细胞，使两者易于分离开， 取上层可用于粒细胞、淋巴细胞培养和实验，下层可用于红细胞培养和实验，经PBS洗3次后即可加入培养基培养，可用于天然白细胞干扰素的诱生和生产。此法 分离的细胞纯度也不高。
3、氯化铵分离法：
0.83%氯化铵（NH4CL）可使红细胞破裂，通常将分离获得的粒细胞。淋巴细胞中混有的少量的红细胞用0.83%氯化铵进行裂 解，以排除红细胞的干扰。另外，此法也适合大量粒细胞、淋巴细胞的分离制备，在天然白细胞干扰素诱生和生产中已被广泛应用。方法如下：
将中心血站供应的健康人外周血离心分离白细胞黄层悬液先经2000r/min离心20min，吸出上清血浆，将下层的红细胞、白细胞混合后，加入0.83 氯化铵，用量为血细胞悬液液量的3倍，于4℃作用20min后离心弃去上清。
在沉淀层中再加入新鲜0.83氯化铵混匀后于4℃作用20min，以便彻底清除红细胞，离心弃上清。
收货下层的细胞用PBS洗3次后，再用含5%人AB型血清的（含100U/ml卡拉霉素）培养基制成悬液，调整细胞浓度为（8-10）x10^9个/L，分瓶加塞在 37℃普通培养箱中旋转培养（12r/h）。
混悬细胞时若加入干扰素诱导剂（NDV-F）诱导22h，收货上清就可生产白细胞干扰素。此法分离的细胞纯度更差。
4、Ficoll分离法：
采用Ficoll和泛影葡胺配制而成的淋巴细胞分离液，通过2000r/min离心后可使血细胞以不同相对密度分离开，如分离淋巴细胞可选用相对密度 1.077的分离液；若分离血小板可用相对密度1.090的分离液，若分离骨髓中的单核细胞常用相对密度1.120的分离液，现以淋巴细胞分离为例，方法 如下。
取中心血站供应的抗凝血细胞或初步分离的白细胞黄层细胞悬液，用无钙、镁离子的PBS稀释3-4倍。
将Ficoll淋巴细胞分离液事先分装于离心管中，使其沉于管底，并在37℃中预热。
用吸管将经稀释的血细胞悬液沿离心管壁缓慢加入，不让细胞悬液冲破分层液界面，使其悬于分层液上方。
以2000r/min离心20min后，不同细胞可依相对密度不同而分布于各位置上，由于红细胞在Ficoll作用下成串下沉，故在离心管中分布在Ficoll层下方，淋巴细胞分布在Ficoll层上方。
收集浑浊带分离获得的淋巴细胞，用无钙、镁离子的PBS洗3次后，再用培养基洗1次后计数，分瓶培养。
此法分离获得淋巴细胞纯度高。
分离液的制备：9% Ficoll（20℃下相对密度约1.020）24份与33.4%泛影葡胺（用泛影钠或Conray400也可，在20℃下相对密度约1.200）10份 混合后，将其相对密度调至1.077金额可获得淋巴细胞分离液，于121℃高压蒸汽灭菌30min，室温保存备用。若配制高相对密度的分离液用加入高浓度 泛影葡胺来调整，若配制低相对密度的分离液用稀释的Ficoll来调整。
望采纳
8、简述主要免疫细胞分离方法和分离原理？
免疫磁珠法分离细胞原理：
免疫磁珠法分离细胞是基于细胞表面抗原能与连接有磁珠的特异性单抗相结合，在外加磁场中，通过抗体与磁珠相连的细胞被吸附而滞留在磁场中，无该种表面抗原的细胞由于不能与连接着磁珠的特异性单抗结合而没有磁性，不在磁场中停留，从而使细胞得以分离。
免疫磁珠法分为阳性分离法和阴性分离法：
阳性分离法－磁珠结合的细胞就是所要分离获得的细胞
阴性分离法－磁珠结合不需要的细胞，游离于磁场的细胞为所需细胞
一般而言，阴性分离法的磁珠用量比阳性分离法的大，阳性分离法用行更多。
BD™ Imag 磁珠：
· 大小在0.1－0.45mm
· 包被了BD Pharmingen生产的高质量单抗
· 磁珠已为白细胞亚群的阳性和阴性分离法所优化
· 用于BD™ IMagnet direct magnet
将包被了特异性单抗的BD IMag磁珠加入细胞悬液，磁珠特异性地与有相应抗原的细胞亚群结合，通过BD™ IMagnet direct magnet分离得到的连有BD IMag磁珠的细胞可直接用于功能试验和用流式细胞仪检测。
缺点：
• 对细胞造成机械压力，影响其生物学活性，不利于分离后培养
• 纯度低
• 容易阻塞FCM的喷嘴
BD IMag吸收大磁珠和小磁珠分离系统的优点，开发出直径约200nm中等大小磁珠。
• 技术简单，分离在普通的试管中完成
• 易于增大细胞用量
• 对细胞温和，不影响细胞功能及其分离后培养，可直接上流式
• 纯度高，回收率高
• 成本低
此外，Mouse lineage panel中biotin标记的抗体还可用于FCM分析细胞表面抗原，以及进行细胞/组织免疫荧光实验。
BD提供2种免疫磁珠：
· 包被了针对白细胞亚群的单抗的磁珠
· 包被了链霉亲和素（streptavidin）的磁珠：此种情况下，在实验系统中加入生物素标记的单抗，磁珠通过streptavidin与生物素标记的单抗结合，单抗与细胞表面相应抗原特异性结合而使细胞被磁珠间接捕获，从而达到分离。这种磁珠使研究者可根据自己需要选择生物素标记的各种单抗去分离目的细胞，应用范围更广泛，使用更灵活。
不同物种磁珠分离试剂
人： CD3, CD4, CD8, CD14, CD19；
小鼠： CD4, CD8a, CD14, CD45R/B220, CD90.2 (Thy1.2), CD11b, Ly-6G.
ë 利用Streptavidin连接的磁珠，只需选配biotin标记的所需单抗,就能分离更多种类细胞
新货聚焦：
现在，BD PMG又推出用于分离小鼠造血干细胞/祖细胞的新试剂mouse lineage panel。
其中包括5种biotin标记单抗，这些单抗能结合小鼠造血细胞的主要分化系细胞: T、B淋巴细胞，单核/巨噬细胞，粒细胞和红细胞。将这组试剂与Streptavidin Plus BD™ IMag Particles (557812) 联合使用，就能通过免疫磁性分离法去除小鼠骨髓造血细胞的主要分化系细胞，从而富集到造血干细胞和祖细胞（阴性片断）。
Mouse Lineage Panel（559971）：（5×2ml/vial） 可分离109 Mouse骨髓细胞
1) Biotin-anti-mouse CD3e (CD3 e chain)；
2) Biotin-anti-mouse CD11b；
3) Biotin-anti-mouse CD45R/B220；
4) Biotin-anti-mouse Ly-6G and Ly-6C (Gr-1)；
5) Biotin-anti-mouse TER-119/Erythroid Cells (Ly-76)
磁分离细胞的重要指标是：
纯度和得率，这取决于磁珠所连接单抗的特异性和磁珠大小（磁性），然而太大的磁珠会影响细胞活性，也无法直接上流式。
目前市场上有2种磁性细胞分离系统：
* Small particles (≈50 nm) － MACS
* Large particles (1200~4500 nm) －others（如Dynal）
小磁珠 优点：
• 对细胞温和，不影响分离细胞的后续培养
• 可直接上流式检测，不影响散射光
缺点：
• 需要很强的磁场来分离细胞
• 分离速度很慢，得率不高
• 需要一次性的分离柱，不能在普通试管进行
• 成本昂贵
大磁珠
• 技术简单，分离可在试管中完成
• 易于增减细胞用量
• 速度快，得率高
• 成本低
9、如何提取小鼠骨髓细胞?
1、颈椎脱臼法处死小鼠(C57型小鼠)，放在75%酒精中侵泡3-5分钟后，拎出后将小鼠铺于超净台上一个消毒托盘上。
2、无菌提取小鼠的四肢骨，用眼科镊小心捏起小鼠两髋关节之间的腹部皮肤，用眼科剪小心剪开皮肤，并分离两下肢的皮肤，往下在脚踝处剪断，往上在髋关节处剪断，这样可以游离出小鼠的两条下肢。
3、小心剥离肌肉，分别剪下Femurs（大腿骨）and Tibias（胫骨）,剪去两端软骨，露出红色的骨髓腔。注意尽可能少的剪走骨髓腔。用纱布将骨头上的肌肉用纱布擦拭干净。
4、拿一支1ml的无菌注射器，每支吸取1mlHBSS液，并用无菌的针头套管将之轻轻拧弯。轻轻插入骨髓腔，冲洗骨髓腔以获得骨髓，一般用2-3ml培养基冲洗两次，可冲出绝大部分细胞。
5、过滤：用2OO目的滤网过滤，将滤网的中央插入到离心管里面25px处，然后用注射器吸取骨髓液，慢慢将骨髓液经滤网注入离心管中，去除残渣。
6、离心：将离心管放置离心机中离心10分钟（1350r/min）
7、去上清，加入1ml红细胞裂解液ACK，静置3分钟，再加9ml HBSS溶液，进行离心10分钟，弃上清。
8、用HBSS液洗涤骨髓细胞2次，室温，1350r/min离心10分钟。计数活细胞，用培养基调整细胞浓度至1X106个细胞/ml.
9、在试管中加入RPMI-1640培养基，然后再加入20ng/ml的细胞因子GM-CSF、5%FBS、0.1%的2-巯基乙醇，
10、吸取培养基加入到沉淀中混匀，24孔板铺板培养，每个孔1ml.
10、分离培养骨髓细胞有何用途
和B细胞融合就是杂交瘤了