骨髓基质细胞的原代培养

1、骨髓间充质干细胞与骨髓基质干细胞是同一种细胞吗

不是一种细胞，具体来源不同，但是都是干细胞，只是分别由基质细胞、间充质分离培养得到。只知道下面这些，希望有帮助

1、间充质干细胞(MSCs)是属于中胚层的一类多能干细胞，主要存在于结缔组织和器官间质中，以骨髓组织中含量最为丰富，由于骨髓是其主要来源，因此统称为【骨髓间充质干细胞】。骨髓间充质干细胞是胎儿和成年人保留在骨髓血液中的原始干细胞，具有强大的生命力，能被诱导分化为血管组织和骨组织，再生能力强；未分化的间充质细胞（undifferentiated mesenchymal cell）是保留在成体结缔组织内的一些较原始的细胞，它们保持着间充质细胞的分化潜能，在炎症与创伤时可增殖分化为成纤维细胞、脂肪细胞。间充质细胞常分布在小血管尤其是毛细血管周围，并能分化为血管壁的平滑肌和内皮细胞。位于器官之间、组织之间以至细胞之间，起连接、支持、营养、防御、保护和修复等功能。
一、具有强大的增殖能力和多向分化潜能，在适宜的体内或体外环境下不仅可分化为造血细胞，还具有分化为肌细胞、肝细胞、成骨细胞、软骨细胞、基质细胞等多种细胞的能力。
二、具有免疫调节功能，通过细胞间的相互作用及产生细胞因子抑制T细胞的增殖及其免疫反应 ，从而发挥免疫重建的功能。
三、具有来源方便，易于分离、培养、扩增和纯化，多次传代扩增后仍具有干细胞特性，不存在免疫排斥的特性。

2、基质细胞群包括成纤维细胞、网状细胞及巨噬细胞等，基质细胞在体外培养可形成CFU-F。造血干细胞被基质细胞包绕后才能增殖。血细胞是在基质细胞形成的网状支架中增殖和分化。

小知识： 干细胞的分类与来源

根据其发育阶段，于细胞可分为胚胎干细胞（Embryonic Stem Cell）和成体干细胞（Alt Stem Cell）。胚胎干细胞包括ES细胞（Embryonic Stem Cell）、EG 细胞（Embryonic Germ Cell）；成体干细胞包括神经干细胞（Neural Stem Ce11， NSC）、血液干细胞（Hematopoietic Stem Cell，HSC）、骨髓间充质干细胞（Mesen chymal Stem Cell，MSC），骨髓基质干细胞，表皮干细胞（EPidexmis Stem Cell）等。

近年，发现不同胚层起源的成体干细胞在一定条件下也可相互转化。如肌肉组织的干细胞可以“横向分化”为血液细胞和脂肪细胞。

2、骨髓的原始细胞包括哪些细胞

骨髓的原始细胞包括粒系细胞、红系细胞、单核系、淋巴系及巨核系，是由造血干细胞向各系祖细胞分化增殖而来。

粒系及红系细胞都依次经过原始细胞阶段，早幼阶段、中幼阶段、晚幼阶段和成熟阶段。淋巴系、巨核系和单核系细胞依次经过原始阶段、幼稚阶段和成熟阶段。

正常骨髓象实际含义是正常范围骨髓象，下降数据可做为骨髓涂片中各种血细胞正常值的参考： 粒细胞系统占比例最大，约占1/2。一般原始粒细胞<0.02，早幼粒细胞<0.05，以中性杆状核最多，其比值大于分叶核细胞，也多于晚幼粒细胞，嗜酸性粒细胞<0.05，嗜碱性粒细胞<0.01。

(2)骨髓基质细胞的原代培养扩展资料

骨髓分布于骨髓腔内，哈佛氏管内也含有少量，它主要是由血窦和造血组织构成。血窦是进入红骨髓的动脉毛细血管分支后形成的窦状腔隙，形状不规则，管径大小不一。窦壁衬着内皮细胞，外面有基膜和周细胞附着。

造血组织位于血窦之间，它的基质是网状纤维和网状细胞，它们构成网架，网孔中充满各种游离细胞，如不同发育阶段的各类血细胞和间充质细胞等。

初生时期，骨内充满的全部是红骨髓，具有活跃的造血功能。成年后，红骨髓主要存在于一些扁骨、不规则骨和长骨的骨骺内，以椎骨、胸骨和髂骨处最为丰富，造血功能也最为活跃。

除造血功能之外，红骨髓还有防御、免疫和创伤修复等多种功能。其创伤修复功能主要缘于其中的幼稚间充质细胞，它们保留着向成纤维细胞、成骨细胞分化的潜能。

一些学者利用红骨髓培养的骨髓基质细胞植入骨折及骨缺损处，证实它们可促进骨组织形成，有利于骨折的愈合和缺损的修复。

3、骨髓基质细胞和骨髓间充质干细胞的区别

骨髓基质细胞是存在于骨髓中的一类多能干细胞，具有分化成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞和其他几种结缔组织细胞（如腱细胞）。亦可转分化成心肌细胞和骨骼肌细胞。骨髓间充质干细胞现已被归为结缔组织成体干细胞。事实上，骨髓基质细胞中的间充质干细胞数量是很少的，约占细胞总数的10万分之一，其定向分化也不均一，现在越来越多的研究揭示骨髓间充质干细胞及其初步分化的祖细胞或称前体细胞(precusor, progenitor cells)具有一些特殊的表面蛋白特征；此外，干细胞具有多向分化及自我更新能力，其细胞复制分裂方式是不对称分裂，这明显不同于普通的细胞。通过贴壁法或Percoll等细胞分离介质只能获得混合的骨髓基质细胞，只有应用免疫磁珠、流式细胞仪等将其进一步分离纯化后，才能称为骨髓间质干细胞。（河南省干细胞库）

4、请教小鼠原代脂肪干细胞的形态及分离培养条件

小鼠脂肪来源干细胞的分离、培养及鉴定

脂肪来源干细胞（Adipose-DerivedStemCells,ADSCs)作为组织工程的种子细胞正受到越来越多的关注。 本实验采用一次消化多次收集与差速贴壁法分离小鼠腹股沟及附睾脂肪组织中的ADSC。通过倒置显微镜观察ADSC的一般形态；透射电子显微镜观察ADSC的超微结构；流式细胞术及激光共聚焦显微镜检测ADSC表面标志；利用特定的诱导液诱导ADSC分化及利用扫描电子显微镜观察ADSC与胶原支架的相容性。 结果显示ADSC呈长梭形或成纤维细胞样，旋涡状或束状交叉生长。ADSC细胞体积大，胞质内含有线粒体及粗面内质网等细胞器。ADSC的生长符合干细胞的生长规律，并可在体外稳定传至第9代。ADSC表达CD44及CD29，不表达CD34。成骨诱导剂诱导后，细胞内碱性磷酸酶表达量增加，细胞基质发生钙化。成脂肪诱导剂诱导后，细胞质内可见较多小脂滴。说明ADSC具有分化为成骨细胞及脂肪细胞的潜能。ADSC能够在胶原支架上铺展生长，说明其与胶原支架具有良好的相容性。 本实验建立了分离、培养小鼠ADSC的技术方法，为将来利用小鼠ADSC进行皮肤、肌腱、血管及神经组织修复的动物实验研究提供了前期实验基础和技术支持。

5、大鼠bmscs细胞和人bmscs细胞的区别

研究骨髓基质细胞(BMSCs)移植对大鼠脊髓损伤(SCI)后血管内皮生长因子(VEGF)蛋白表达及神经细胞凋亡的影响,探讨骨髓基质细胞移植治疗脊髓损伤的机制。[方法]取大鼠股骨和胫骨骨髓培养BM-SCs并传代。参照Taoka′s方法制作大鼠脊髓压迫损伤模型。脊髓损伤后30 min,进行BMSCs或DMEM培养液损伤周围注射。术后3、7和14 d,应用Western Blot法检测损伤脊髓组织内VEGF蛋白的表达,应用TUNEL方法检测脊髓损伤周围神经细胞凋亡情况。[结果]移植术后3、7、14 d,BMSCs组VEGF蛋白的表达水平呈时间依赖性增加,与DMEM组相比,术后3 d两组VEGF蛋白表达水平没有显著性差异(P>0.05),而术后7和14 d,BMSCs组VEGF蛋白表达水平显著高于DMEM组(P<0.01)。此外,与DMEM组大鼠相比,移植术后3、7和14 d,BMSCs移植显著减少脊髓损伤周围区凋亡的神经细胞数目(P<0.05)。[结论]脊髓损伤后,BMSCs移植能够增加VEGF蛋白的表达并且抑制神经细胞凋亡。

6、骨髓基质细胞原代培养好做吗

原代细胞(primarycell)是指从机体的组织(如人组织、小鼠组织、大鼠组织和兔组织等)经蛋白酶或其它的方法获得单个细胞并在体外进行模拟机体培养的细胞，称为原代细胞。一般认为，培养的原代的第1代细胞和传代到第10代以内的细胞统称为原代细胞培养。在人工条件下使其原代细胞生存、生长、繁殖和传代，进行细胞生命过程、细胞癌变、细胞工程等问题的研究。细胞株(cellstrain)是通过选择法或克隆形成法从原代培养细胞中获得具有特殊性质或标志物的细胞称为细胞株。一般认为，细胞株是用单细胞分离培养或通过筛选的方法，由单细胞增殖形成的细胞群。细胞株的特殊性质或标志必须在整个培养期间始终存在。细胞系(cellline)是原代细胞经首次传代成功后即为细胞系。泛指一般可能传代的细胞。其中能够连续传代的细胞叫做连续细胞系或无限细胞系，不能连续培养的称为有限细胞系。大多数二倍体细胞为有限细胞系。由原先存在于原代培养物中的细胞世系所组成。如果不能继续传代，或传代次数有限，可称为有限细胞系(finitecellline)，如可以连续培养，则称为连续细胞系(continuouscellline)，培养50代以上并无限培养下去。人类肿瘤细胞，在体外培养半年以上，生长稳定，并连续传代的即可称为连续性株或系。

7、哪位做过脂肪细胞原代培养

方案 23.12 脂肪细胞的原代培养

实验材料

DMEM-ADMEM-B胶原蛋白酶雄性 Sprague-Dawley 大鼠

试剂、试剂盒

KRBH缓冲液KRBH-A缓冲液

仪器、耗材

Petri培养皿锥形离心管聚丙烯管低密度聚丙烯瓶尼龙滤网尖解剖剪Perry镊塑料箱铡刀移液器

实验步骤

一、切除附睾脂肪垫

1. 在充有 70 % CO2 和 30 % O2 混合气体的塑料箱内麻醉大鼠（雄性 Sprague-Dawley 大鼠：145~170 g，CD 系（Charles River Breeding Laboratories）。

2. 用铡刀断头放血。

3. 将鼠体在 70 % 乙醇内浸泡一会儿。

4. 尽量在无菌条件下切除附睾脂肪垫。

(a)用一把解剖剪剖开下腹部皮肤，暴露腹膜。

(b)用另一把解剖剪剖开腹膜，然后用 Perry 镊向上牵拉睾丸。

(c)剪取附睾脂肪垫，注意保留血管。

5. 将组织移送到培养实验室。

脂肪细胞的胶原蛋白酶（在 2 ml KRBH 缓冲液加入 20 mg/ml 胶原蛋白酶，然后用 0.22 μm 滤器过滤）消化和洗涤

6. 将 4 g 脂肪垫（相当于 8 个附睾的脂肪垫）放入盛有 4 ml KRBH 缓冲液 （Krebs-Ringer 液，pH 7.4，添加 10 mmol/L NaHCO3、30 mmol/L HEPES（Sigma）、200 nmol/L 腺苷（Boche）和 1 % BSA （W / V，Intergen）。配制 1 L KRBH 缓冲液时，用 7 g NaCl、0.55 g KH2PO4、0.25 g MgSO4 7H2O、0.84 g NaHCO3、0.11 g CaCl2、7.15 g HEPES、10 g BSA、1 ml 200 μmol/L 腺苷， 加超净水至 1 L。然后，按 100 ml 分装。使用前加热至 37°C，并将 pH 调整至 7.4。）（37°C）的 30 ml 低密度聚丙烯瓶内。

7. 将脂肪垫剪成直径约为 2 mm 的组织块。

8. 将组织块放入瓶内，然后加入 1 ml 胶原蛋白酶液。在 37°C 水浴振荡器孵育约 1 h，直至细胞混合物形成乳脂样浓稠液体。

9. 胶原蛋白酶消化后，向瓶内加入 4 ml KRBH 缓冲液（37°C）。

10. 通过搅拌混匀瓶内的细胞，然后用孔径为 250 μm 的尼龙滤网（孔径为 250 μm，放入支持物或漏斗内）将细胞轻轻滤入 50 ml 锥形离心管。

11. 通过向离心管内加入 30 ml KRBH 缓冲液（37°C）洗细胞。用台式离心机短时间离心（ 200 g），然后用吸管吸出下清液。注意脂肪细胞浮在水性缓冲液的上面。

12. 通过加入 40 ml KRBH 缓冲液洗细胞，离心，除去下清液。重复该步骤 1 次。

13. 用 40 ml DMEM-A （DMEM，pH 7.4，添加 25 mmol/L 葡萄糖、2 mmol/L 谷氨酰胺、200 nmol/L（R )-N6-（l-methyl-2-phenylethyl）腺苷（PIA，Sigma）、100 μg/ml 庆大霉素和 25 mmol/L HEPES。按 100 ml 分装，使用前加热至 37°C）（37°C）洗细胞 2 次。

14. 用约 40 % cytocrit DMEM-A 混悬漂浮的细胞。

二、脂肪细胞的原代培养

15. 用 200 μl 大口径吸头将 2 ml 40 % cytocrit DMEM-A 悬液移入 60 mm 培养皿。

16. 将培养皿放入湿润的培养箱，在 37°C 和 5 % CO2 的条件下培养 1.5 h 。

17. 向培养皿内加入 5 ml DMEM-B（DMEM-A，添加 7% BSA）。

此时，应进行葡萄糖摄取实验 [ Quom 1998 ]，检査细胞的活力。

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中山医科大学学报(AcadJSUMS),2001,22(6):443~446443

人前脂肪细胞的原代培养

王竹晨1,刘建中2,李??燕2,杨冬梓1,邝健全1

(中山医科大学??1.孙逸仙纪念医院妇产科,2.生物教研室,广东广州??510120)

摘??要:??目的 建立人前脂肪细胞原代培养方法,以更深入地研究人体脂肪组织增生的生物学特征。??方法 选用成人的腹部脂肪组织,采用原代消化细胞培养法培养出棱形细胞;同时取皮肤组织,进行成纤维细胞培养作为对照。??结果 培养出的棱形细胞成分均一,增殖旺盛,分化率高。经形态学动态变化的观察,生长曲线及油红O脂肪染色抽取法测定,证明是功能活跃的前脂肪细胞,并在体外重现了其增殖的全过程。??结论 在成熟的脂肪组织中存在着可分化成熟、生成脂肪的前脂肪细胞。由于脂肪细胞是胰岛素作用的经典靶细胞之一,本实验为进一步研究与肥胖及胰岛素抵抗相关的疾病如多囊卵巢综合症等打下了基础。

关键词:前脂肪细胞;细胞培养;脂肪组织

中图分类号:Q254,R711.75??????文献标识码:A??????文章编号:1000-257X(2001)06-0443-04

WANGZhu??chen1,LIUJian??zhong2,LIYan2,YANGDong??zi1,KUANGJian??quan1

(1.,SunYat??senMemorialHospital,2.DepartmentofBiology,

SunYat??,Guangzhou510120,China)

Abstract:??Objective .??Methods Usingprimarycellculture,fibroblast??..??Results Thecellswerehighlyhomogeneous,.,growthcurve,,.Undercontrolledconditions,.??Conclusion Inmaturehumanadiposetissue,.,thisstudylaidthebasisforfur??syndrome.

Keywords:preadipocyte;cellculture;adiposetissue

????脂肪细胞是胰岛素作用的经典靶细胞之一,与

肥胖及胰岛素抵抗相关疾患如多囊卵巢综合症的

研究关系密切,近年来受到妇科内分泌领域的重

视。前脂肪细胞是一类具有增殖和向脂肪细胞分

化能力的特异化的前体细胞,它的存在和作用持续

于人的一生,我们从人脂肪组织中培养出了前脂肪

细胞,为进一步研究打下了基础。

????收稿日期:2001-04-23

????基金项目:广东省卫生厅科研基金资助课题(2001189)

????,;1??材料与方法1.1??组织来源选取2000年9月~2001年1月本院妇科内分泌病房行输卵管复通术的正常体重患者。年龄20~40岁,身体健康,无其他急慢性疾病。术中开腹时切取皮下脂肪组织及皮肤组织。

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1.2??试验材料

1.2.1??主要试验用品和化学试剂??DMEM/F??12培养基(1!1),无支原体胎牛血清,?型胶原酶,Hepes,人转铁蛋白,青、链霉素原液均购自GIBCO公司;生物素、泛酸盐、氢化可的松,三碘甲状腺原胺酸(T3),3??异丁基??1??甲基黄嘌呤均系SIGMA公司产品。牛血清白蛋白购自Roche公司。试验所需无机试剂购自广州市医药公司化试批发部,均系分析纯试剂。培养瓶购自KORNING公司。

1.2.2??培养基及主要试剂的配制??培养基A[1]中山医科大学学报(AcadJSUMS),2001,22(6)培养基A制成细胞悬液,接种至25cm2培养瓶内,密度为每平方厘米3?10个细胞,置37#,体积分数5%CO2培养箱内孵育16h后,PBS轻轻洗去培养瓶内未粘附的物质,换用培养基C诱导和维持脂肪细胞分化,3d后更换为培养基B,以后每2~3d更换一次培养基B。1.3.2??人前脂肪细胞及皮肤成纤维细胞的组织学染色??盖玻片剪成0??5cm?1??0cm大小,接种时置入培养瓶内,待细胞贴壁后每2、3d从培养瓶内取出染色。将贴有脂肪细胞的面朝上,浸入体积分

数为10%甲醛的等渗盐缓冲液中固定10min,然后放入PBS缓冲液中,轻轻漂洗片刻,直立使残留水份流到边缘,吸水纸吸掉。稍干燥后,人前脂肪细胞采用苏丹%??&滴染法及Mayer苏木素复染细胞核,甘油明胶封片;皮肤成纤维细胞采用常规苏木素-伊红染色,脱水透明后中性树脂封片,光镜观察并拍照保留结果。

1.3.3??细胞生长曲线的绘制??将细胞悬液等量接种至24个培养瓶内,随机分成8组,每组3瓶,每2d检测一组中每个瓶中的细胞总数,取3个瓶的均值,如此至第8组结束。细胞计数方法参照医学细胞生物学实验[3]。

1.3.4??油红O染色提取法测定细胞内的脂肪含量??接种方法同1.3.3,根据Ramirez[2]4:按说明取DMEM/F??12培养粉5g,加入胎牛血清使其体积分数为10%,三蒸水定容至500mL;培养基B:按说明取DMEM/F??12培养粉10g,加入终浓度分别为15mmol/LNaHCO3,15mmol/LHep??es,33??mol/L泛酸盐,17??mol/L人转铁蛋白,100000U/L青霉素,0??1g/L链霉素,100nmol/L氢化可的松,60nmol/L胰岛素,0??2nmol/LT3,三蒸水定容至1000mL;培养基C:取培养基A200mL,加入3??异丁基??1??甲基黄嘌呤,使其终浓度为0??25mmol/L;消化液:称取胶原酶(?型)150mg,牛血清白蛋白2g,0??01mol/L磷酸缓冲盐溶液(PBS)定容至100mL;红细胞溶解缓冲液:称取适量NH4Cl,K2HPO4和EDTA,使其终浓度分别为154mmol/L,5??7mmol/L,和0??1mmol/L,三蒸水

定容至250mL。上述溶液均经调整pH值至7??4~7??6,0??22??m微孔滤膜正压过滤除菌,分装后置-30#保存。油红O工作液[2]等的方法测定。培养物用体积分数10%甲醛的等渗盐缓冲液固定1h后,蒸馏水漂洗。吸取油红O工作液10mL,使培养面向下浸染,2h后倒掉瓶内的油红O

工作液,蒸馏水漂洗培养瓶数次,直至完全漂浮干净。将已染色的培养瓶置于32#孵箱内蒸发掉瓶内的水份后即加入1mL异丙醇,萃取出的染液即刻用吸管移出,于HITACHIG2000型分光光度计510nm波长处测吸光度。:称取4??2g油红O溶于1200mL异丙醇中室温静置过夜,分析滤纸过滤后收集滤液,并加入900mL三蒸水,于4#再次静置过夜后过滤两次即可于室温贮存备用。1.2.3??仪??器??CO2培养箱,倒置显微镜等。1.3??方??法

1.3.1??人前脂肪细胞及皮肤成纤维细胞的原代培养[1]??术中切取脂肪组织约60g,同时切取皮肤组织约0??5cm?3cm进行成纤维细胞培养作为对照。PBS洗涤,分离去除脂肪组织中肉眼可见的纤维成份及血管,皮肤组织则需去除表皮和皮下脂肪,剪碎成约2mm?2mm的小块,加入消化液,置37#,体积分数5%CO2培养箱内消化。15h后,200?g短时离心,去除漂浮的脂肪细胞及培养液,沉积的细胞用红细胞溶解缓冲液再次配成细胞悬液,37#孵育10min,以去除污染的红细胞,150??2??结??果2.1??原代培养的人前脂肪细胞及皮肤成纤维细胞形态学观察细胞贴壁后初为小圆形,核/浆比例较大(图1??1),4d即可观察到细胞渐成梭型,7d左右此棱形细胞大量繁殖,面积达到培养瓶底1/2之后开始积聚脂肪颗粒(图1??2)。9d可观察到细胞由棱形渐变成椭圆形或圆形(图1??3),积聚有脂肪颗粒的

第6期??王竹晨,等.人前脂肪细胞的原代培养445肪细胞(图1??4)。体外培养的脂肪细胞体积较大,细胞膜较薄,膜轮廓不光滑,凹凸不平有皱折,胞质内有大量圆形脂滴,大小不等且多散在,也有小脂滴大量触合成大脂滴的情况,核仍位于边缘,而同时培养的皮肤成纤维细胞增殖速率相似,但始终为长棱形,无脂滴积聚(图2??1,图2??2)。

2.2??人前脂肪细胞及皮肤成纤维细胞的生长曲线

由生长曲线可见人前脂肪细胞(图3??1)和皮肤成纤维细胞(图3??2)的倍增时间分别为60h和55h

。3??讨??论3.1??人前脂肪细胞培养在妇科内分泌领域的研究意义脂肪细胞是脂肪组织的重要组成部份,也是其发挥功能的主体。当代研究认为脂肪组织中脂肪细胞非常活跃,细胞的数目,形态及细胞内脂肪的含量均处于动态变化之中,并保持终生。肥胖症被认为是脂肪细胞增殖和分化失控的结果。目前,肥

胖已成为与妇科内分泌领域密切相关的疾病,肥胖可产生胰岛素抵抗/高胰岛素血症,而胰岛素抵抗/高胰岛素血症是许多临床疾病或病症,尤其是常见的内分泌代谢性疾病如糖尿病、高血压和动脉粥样硬化等的共同危险信号,因此成为近年医学多学科共同感兴趣的研究热点。特别是近年的研究发现

图3.1??人前脂肪细胞生长曲线

Fig.3.1??

culture胰岛素抵抗/高胰岛素血症还与育龄妇女高雄激素血症及无排卵有关。临床常见的多囊卵巢综合症,

生育年龄妇女中约有5%~10%患者此症,常伴有肥胖,病因不明。目前认为多囊卵巢综合症即是以胰岛素抵抗为特征的内分泌代谢性疾患,继发于胰岛素抵抗的高胰岛素血症对造成高雄激素征象起着重要作用,并致不孕[4]。脂肪细胞作为对胰岛素

图3.2??人皮肤成纤维细胞生长曲线

Fig.3.2??敏感的靶细胞之一,因此对其潜在胰岛素抵抗机制的研究具有特殊临床意义。体外前脂肪细胞培养

能完整地认识脂肪组织的发生和增生的全过程,并且可以直接观察各种因素对这个过程的调控,研究其机制,是研究脂肪组织的理想模型。国外虽已建立了来源于鼠的前脂肪细胞的细胞株如3T3??L1、3T3??F442A,ob17系列等,但到目前为止,尚未见有人的前脂肪细胞株建立[5],因而使进一步的研究受到了限制。

3.2??体外培养的人前脂肪细胞的生物学特性

目前国内外前脂肪细胞体外培养系统大致有两类,一类来源于血管基质组份细胞(stromalvas??cularfraction,SVF),这是经典的前脂肪细胞。Van等[6]对SVF的系统研究形成了完整的前脂肪细胞理论。他们将切下的脂肪组织用胶原酶处理,再将组织悬液离心,其中的沉淀物基质血管成份即是SVF,将其SVF进行培养,和培养的成纤维细胞比较,这两种培养物以差不多的速率增殖,倍增时间约55h左右。在显微镜下比较细胞,发现起初2.3??前脂肪细胞及皮肤成纤维细胞生长过程中细胞内脂肪含量的变化前脂肪细胞内的脂肪含量于培养9d后迅速增加,16d左右到达高峰,而皮肤成纤维细胞内仅有极少的脂肪积聚(图4)

。图4??前脂肪细胞及皮肤成纤维细胞生长过程中细胞内脂肪含量的变化Fig.4??lture

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可积聚大量脂滴,而成纤维细胞的胞浆内则无或只有少量的脂滴。这就证明了SVF是具有增殖和向脂肪细胞分化潜能的前脂肪细胞。本实验研究结果与之相符,符合文献中提出的3个标准[6]。此外,近年还有人报道采用脂肪组织块贴壁和天花板培养相结合的方法也获得了成功[7]。此种方法得到的前脂肪细胞与SVF不同,可能来源于Carraro等发现的成熟脂肪细胞内都有的一种细胞岛[8]。但此种方法是采用有血清培养并且与成熟脂肪细胞共同孵育,不适于作为成熟脂肪细胞所分泌的某些细胞因子的体外研究模型。

前脂肪细胞的培养阐明了其增殖和分化的关系,目前认为这是一种生长停顿?生长再续?细胞分化的连续关系。生长停顿是必要的第一步,此后这些细胞至少进行一次以上的再分裂,才继续向成熟脂肪细胞转化。并随时间的推移出现甘油??3??磷酸脱氢酶(GPDH)mRNA这个晚期标志物,这也是脂肪合成所必需的限速酶,并最终变成脂肪细胞。我们的研究也观察到细胞贴壁后经过一段时间的潜伏期后开始生长,3、5d左右大量增殖,1周后开始有脂肪颗粒的积聚。培养2周时,分化成多脂滴或单脂滴的脂肪细胞,与文献报道一致。

油红O染色提取法可简便、快速地对体外培养的前脂肪细胞转化率进行定量。文献报道其准确性和敏感性与测定前脂肪细胞分化过程中的标志酶GPDH相似[2]。因此常用来作为对体外培养的前脂肪细胞进行鉴定。体外培养的前脂肪细胞在胰岛素、氢化可的松等的作用下,GPDH即开始上升并迅速增加,8d左右达到高峰并维持在高水平[2]。我们采用油红O染色提取法进行研究,结果表明,前脂肪细胞在培养第3天即开始有脂肪的积聚,1周后积聚量明显增多,2周时达到高峰,与形态学上的培养1周后细胞内开始出现脂肪颗粒相吻合。并说明酶的出现在先,脂肪出现在后,细胞内脂肪含量的明显增加比GPDH的出现要晚1周左右,与文献报道相吻合[2]。

3.3??人前脂肪细胞培养技术的特点

脂肪组织来源于原始的网状结缔组织,由结缔组织和脂肪细胞组成,细胞成分中以脂肪细胞为主,此外还含有网状细胞,间充质细胞,组织细胞,内皮细胞等。脂肪细胞和成纤维细胞均来自中胚层,因此培养脂肪细胞和培养成纤维细胞具有相似[9]中山医科大学学报(AcadJSUMS),2001,22(6)外培养条件有差异[10],不同的是需要促脂肪形成因子的作用,目前已知的这类物质有:胰岛素、糖皮质激素、甲状腺素、生长激素、转铁蛋白,3??异丁基??1??甲基黄嘌呤,纤维粘连素等。培养基一般采用DMEM和F12按1!1比例配制,细胞数量适中,初次接种时细胞贴壁不十分牢固,动作要轻柔以免细胞漂浮。选用的取材对象越年轻越容易生长。人类一般选用外科手术切取腹部脂肪组织,如用注射器抽吸则易损伤细胞,降低成活率。(本文图1,2见插页2)参考文献:[1]HaunerH,PetruschkeTH,RussM,etal.(TNF??)??[J].Dibetologia,1995,38(7):764.[2]Ramirez??ZacariasJL,Castro??MunozledoF,kuri??Har??cuchW.??[J].Histochemistry,1992,97(6):493.[3]赵??刚,刘建中.医学细胞生物学实验与习题[M].北京:科学出版社,1999.35.[4]DunaifA.??drome[J].Endocrinol&MetabClinNorAm,1999,28(2):341.[5]BillingsE,MayJW.Historicalreviewandpresentsta????constructivesurgery[J].PlastReconstrSurg,1989,83(2):368.[6]VanRLR,BaylissCE,RoncariDAK.rsinculture[J].JClinInvest,1976,58(9):699.[7]朱晓海,何清濂,林子豪.人前脂肪细胞培养及增殖与分化模型的建立[J].中华整型烧伤外科杂志,1999,15(3):199.[8]CarraroR,LiZH,JohnsonJE.ntratadipocytes[J].CellTissRes,1991,264(2):243.[9]刘??清,邓漪平.内皮-平滑肌联合培养:细胞间相互作用对组织型纤溶酶原激活剂的影响[J].中山医科大学学报,1992,13(4):18.[10]朱永源,利天增,苏爱云,等.人表皮细胞的体外培养[J].中山医科大学学报,1998,19增刊:34.(??,)

8、胶原酶和胰酶在细胞原代培养中的区别

酶的浓度 胰蛋白酶一般采用的浓度为 0.1%-0.25%（活力 1:200 或 1:250），但遇到难消化的组织时，浓度可适当提高，消化时间适当延长。浓度高对细胞有毒性，而较低浓度的胰蛋白酶在培养液中可促进细胞的增殖，若培养液中加入血清，其少量胰蛋白酶可被血清中抗胰蛋白酶因子所清除。

温度 一般认为胰蛋白酶在 56℃时活性最强，但由于对细胞有损害而不能被采用，常使用的温度为 37℃，通常在 37℃进行消化比室温作用快。

pH pH8~pH9 是胰蛋白酶活力适宜范围，但随碱性的增加其活力也随之减少，活性强分散快，细胞也容易被消化下来，消化分离细胞时 PH 只能选用 7.6~8.0 之间，否则对细胞有损伤。

无机盐离子 若用含有钙和镁的盐类溶液来配制胰蛋白酶时，可以发生抑制胰蛋白的消化作用。因此，在配制时应采用无钙镁离子的 PBS 配制。

　  消化时间 如果细胞消化时间过长，可以损害细胞的呼吸酶，从而影响细胞的代谢，一般消化时间为 20 分钟为宜，冷消化时使用低浓度消化液，于 4℃过夜也可。

分离方法如下：

①过夜冷消化 将取得的组织用 Hanks 液洗三次，剪成碎块大小为 4 毫米左右，用 Hanks 液洗 2~3 次以除去血球和脂肪组织，再加入 0.25% 的胰蛋白酶，摇匀后放 4℃过夜，次日再用 Hanks 液洗涤，弃去上清，共洗 2~3 次，然后，加入少量营养液吹打分散，细胞计数，按适当的浓度分瓶培养。

②多次提取消化法 多次提取消化法有以下三种：

热消化多次提取 -- 将剪碎的细胞块加入 0.25% 胰蛋白酶 37℃水浴中消化 15~20 分钟，然后经洗涤后用营养液分散制成细胞悬液，按合适的浓度分瓶培养，然后将留下的未彻底消化的组织按上述方法操作，再消化提取细胞。

冷消化多次提取 -- 方法同上，只是消化温度为 4℃。

先热消化后冷消化 -- 将组织块先用胰蛋白酶于 37℃下消化 20 分钟经洗涤后用营养液分散，制成悬液，剩余未消化的小组织块经洗涤后用胰酶于 4℃下过夜，次日再提取细胞，分散成悬液，分瓶培养。

 胶原酶（Collagenase）消化法

胶原酶是一种从细菌中提取出来的酶，对胶原有很强的消化作用。适于消化纤维性组织、上皮组织以及癌组织，它对细胞间质有较好的消化作用，对细胞本身影响不大，可使细胞与胶原成分脱离而不受伤害。该酶分离效果好，即使有钙、镁离子存在仍有活性，故可用 PBS 和含血清的培养液配制，即操作简便又可提高细胞成活率，最终浓度 200u/mL 或 0.1~0.3mg/mL. 此酶消化作用缓和，无需机械振荡，但胶原酶价格较高，大量使用将增加实验成本。

经过胶原酶消化后的上皮组织，由于上皮细胞对酶有耐受性，可能有一些上皮细胞团块尚未被完全消化开。成小团块的上皮细胞比分散的单个上皮细胞更易生长，因此不必要再进一步消化处理。

非酶消化法（EDTA 消化法）

EDTA 是一种非酶消化物，又称螯合剂或 Versene, 全名为乙烯二胺四乙酸。常用不含钙、镁离子的 PBS 配成 0.02% 的工作液，对一些组织，尤其是上皮组织分散效果好，该化学物质能与细胞上的钙、镁离子结合形成螯合物，利用结合后的机械力使细胞变圆而分散细胞或使贴壁细胞从瓶壁上脱离，缺点是细胞易裂解或贴壁细胞从瓶壁上脱离时呈片状，有团块，常不单独使用，但可与胰蛋白酶混合使用（1:1 或 2:1），不仅利于细胞脱壁又利于细胞分散，可降低胰酶的用量和毒性作用。

消化分离法的操作步骤：

（1）剪切 把组织块剪碎，呈 1~5mm3 大小的组织块。

（2） 加液漂洗 将碎组织块在平皿（或三角烧瓶）中用无钙镁 PBS 洗 2-3 次（采用倾斜，自然沉降法）。

（3）消化 加入消化液（胰蛋白酶或胶原酶或 EDTA）于 37℃水浴中作用适当时间（中间可轻摇 1~2 次），若组织块膨松呈絮状可终止，若变化不大可更换一次消化液，继续消化直至膨松絮状为止。胰蛋白酶消化时间不宜过长。

（4）弃去消化液 采用倾斜自然沉降或低速离心法尽量弃去消化液。

（5）漂洗 将含有钙、镁离子的培养基沿瓶壁缓缓加入，中止消化反应，采用漂洗法洗 2-3 次后，加入完全培养基。

（6）机械分散 采用吸管吹打或振荡法，使细胞充分散开后用纱网或 3~4 层无菌纱布过滤后分瓶培养，若要求不高可采用倾斜自然沉降 5~10 分钟，吸上层细胞悬液进行分瓶培养。

注意事项如下：

（1）组织块必须漂洗 2-3 次以除去组织中的钙、镁离子和血清对胰蛋白酶和 EDTA 的抑制作用。

（2）胰蛋白浓度不宜过高，作用时间不能太长，以避免毒性作用。

（3）消化后组织不仅要尽量弃去消化液，以避免毒性产生，而且动作要轻，以避免膨松的细胞随漂洗而丢失。

　  原代细胞的培养方法

原代细胞的培养也叫初代培养 是从供体取得组织细胞在体外进行的首次培养，是建立细胞系的第一步，是一项基本技术。原代细胞因刚从组织中分离开，生物学特性未发生很大变化，仍保留原来的遗传特性，也最接近和反映体内生长特性，适宜用于药物敏感性试验、细胞分化等实验研究。

原代细胞往往有多种细胞组成，比较混杂，即使从形态上为同一类型（上皮样或成纤维样），但细胞间仍有很大差异。如果供体不同，即使组织类型、部位相同，个体差异也照样存在，原代细胞生物特性尚不稳定，如需做较为严格的对比性实验研究，还需进行短期传代培养。

1、组织块培养法

组织块培养是常用、简便易行和成功率较高的原代培养方法，也是早期采用培养细胞的方法，故原先被称为组织培养。其方法：为将剪成的小组织团块接种于培养瓶（或皿）中，瓶壁可预先涂以胶原薄层，以利于组织块粘着于瓶壁，使周边细胞能沿瓶壁向外生长，方法简便，利于培养，部分种类的组织细胞在小块贴壁 24 小时后细胞就从组织块四周游出，然后逐渐延伸，长成肉眼可以观察到的生长晕，5~7 天后组织块中央的组织细胞逐渐坏死脱落和发生漂浮，此漂浮小块可随换液而弃去，由组织块周围延伸的贴壁细胞也逐渐形成层片，可在显微镜下观察形态和用于实验研究。

其培养方法如下：

（1）按照前述方法取材，将组织剪成或切成 1mm3 大小的小块，并加入少许培养基使组织湿润。

（2）将小块均匀涂布于瓶壁，每小块间距 0.2 cm~0.5cm，一般在 25mL 培养瓶（底面积为 17.5cm2）可接种 20~30 小块为宜，小块放置后，轻轻翻转培养瓶，使瓶底朝上，然后于瓶内加入适量培养基盖好瓶塞，将瓶倾斜放置在 37℃温箱内。

（3）培养 2~4 小时，待小块贴附后，将培养瓶缓慢翻转平放，静置培养，动作要轻，严禁摇动和来回振荡，以防由于冲动而使小块漂起而造成培养失败，若组织块不易贴壁可预先在瓶壁涂一薄层血清、胎汁或鼠尾胶原等。开始培养时培养基不宜多，以保持组织块湿润即可，培养 24 小时后再补液，培养初期移动和观察时要轻拿轻放，开始几天尽量不去搬动，以利贴壁和生长，培养 3~5 天时可换液，一方面补充营养，一方面去除代谢产物和漂浮小块所产生的毒性作用。

原代细胞培养 -2

2、消化培养法

该方法是采用前述的消化分散法，将妨碍细胞生长的细胞间质（包括基质、纤维等）去除，使细胞分散形成细胞悬液，然后分瓶培养。

某些特殊类型细胞，如内皮细胞、骨细胞等的消化手段和步骤，将在有关章节中叙述。

3、悬浮细胞培养法

对于悬浮生长的细胞，如白血病细胞、淋巴细胞、骨髓细胞、胸水和腹水中的癌细胞和免疫细胞无需消化，可采用低速离心分离，直接培养，或经淋巴细胞分层液分离后接种培养。

4、器官培养

器官培养是指从供体取得器官或组织块后，不进行组织分离而直接在体外的特定环境条件下培养，其特性仍保持原有器官细胞的组织结构和联系、并能存活，器官培养的目的和技术均与单层细胞培养不同，但可利用器官培养对器官组织的生长变化进行体外观察。并观察不同培养条件研究对器官组织的影响。器官培养可保持器官组织的相对完整性，可用于重点观察细胞间的联系、排列情况和相互影响，以及局部环境的生物调节作用。体外器官培养为临床上的器官移植创造了便利的条件。器官培养的条件与细胞培养不同，要有特殊的要求。

1、器官培养的特殊的要求

（1）需要特殊的培养条件 因器官离体培养，其营养和氧气仅靠自然渗透来供给，因此，培养时为了确保中心不发生缺乏氧和营养而造成坏死，其厚度或直径不宜超过 1mm.

（2）器官内部细胞需要有足够的氧气渗入 常采用以下两种方法：

a. 将器官组织块置于培养基气液面以利于气体交换。

b. 提高培养基中的氧分压，一般需加注纯氧，提高氧分压时仍需保持 5% CO2, 以维持 pH.

2、器官培养的方法

（1）将不锈钢网做成的支架，放置于培养皿中，高度为 1/2 皿高，使其表面铺上 0.5mm 孔径的滤膜。

（2）将培养基加入平皿中，使培养液刚刚接触到滤膜，但不要使滤膜浮起。

（3）将要培养的器官组织平放在滤膜上，一般厚度不要超过 200μm, 水平面积不超过 10mm2, 如为肝、肾不能大于 1mm2.

（4）将培养物置于 CO2 培养箱内，并加注氧气，调整氧分压达 90%, 培养时注意使液面与膜保持在一致的水平上。

（5）上述器官培养 1~3 周（每隔 2~3 天换液一次）后可用于实验和检测。