rnai技術與骨質疏鬆

1、RNAi 的原理是什麼?

rna干擾的分子抑制機制的三種方式及原理
轉錄抑制

與有關的dsrna及蛋白質可參與染色質的修飾作用，使其中的組蛋白和dna發生甲基化作用，使相應基因不能被轉錄，從而導致受阻基因不能表達。這種在轉錄水平上阻斷基因功能，使基因沉默的rnai方式被稱為轉錄基因沉默(transcriptional
gene
silencing,tgs)。這種現象先在植物中得到證實,但是在哺乳動物中是否存在仍有爭議。2004年svoboda等研究表明，在小鼠卵母細胞中，通過rnai引起靶基因表達沉默的長dsrna不能引起相應dna區域從頭合成dna的甲基化。morris等也於同年得出實驗結論，針對內源基因啟動子的sirna能夠引起其區域內cg島以及組蛋白h3k9的甲基化，從而在轉錄水平抑制基因的表達。
轉錄後抑制
不同來源的dsrna通過各種轉基因技術轉入植物、線蟲或哺乳動物細胞內，、被切割產生sirna片斷，再由合成的risc切割靶mrna從而阻斷基因表達。這種基因能正常轉錄成mrna，但mrna因被降解使基因功能被阻斷，這種rnai方式叫做轉錄後沉默(post
transcriptional
gene
silencing,ptgs)。sirna對靶mrna降解具有序列特異性，只能引起同源mrna降解，如果sirna與mrna有一個bp不配對，rnai作用就極大降低，如果兩者有4個bp不配對，就不能產生rnai。
翻譯抑制

grishok等在研究rnai時，發現在細胞中在細胞中存在內源性小片段單鏈rna(ssrna)，其長度也在21～25
nt之間，這種ssrna可與mrna的3′非翻譯區(3′utr)特異性地結合，從而抑制mrna的翻譯和相應的功能蛋白質合成。這種小片段的ssrna叫做strna(small
temporal
rna)。ssrna的形成是因為當rna的大小為70～80
nt時，容易形成雙鏈的莖環狀結構，其雙鏈莖的長度正好在21～25
nt之間，這樣的雙鏈結構易被dicer酶識別並切割成strna，由strna抑制翻譯。這種方式的rnai也作用於轉錄後形成的mrna，它在調節生物細胞內基因的表達、自身的發育方面起著重要的作用。

2、求RNAi技術和TALEN技術的優缺點

其實TALEN很好，很新，比慢病毒還要好，而慢病毒比RNAi好。
shRNA可以在幹細胞，神經細胞，胚胎幹細胞等難轉染的細胞中高效率的蛋白，他的啟動子等都是外源的，表達蛋白的翻譯後修飾可能會不夠真實，而TALEN可以更好的彌補他的缺陷。第一，TALE靶點識別模塊構建。TAL的核酸識別單位為重復34個恆定氨基酸序列，其中的12、13位點雙連氨基酸與A、G、C、T有恆定的對應關系，即NG識別T，HD識別 C，NI識別A，NN識別G。為獲得識別某一特定核酸序列的TALE，只須按照DNA序列將相應TAL單元串聯克隆即可。由於物種基因組大小的不同，選擇的特異序列長度也不同，對於哺乳類動物包括人類，一般選取16-20bp的DNA序列作為識別靶點。第二，
TALEN的基因敲除
將識別特異DNA序列的TALE與內切核酸酶FokI偶聯,可構建成剪切特異DNA序列的內切酶TALEN。而且FokI需形成2聚體方能發揮活性，大大減少了隨意剪切的幾率。在實際操作中，需在目標基因的編碼區或外顯子和內顯子的交界處選擇兩處相鄰（間隔13-22鹼基）的靶序列（一般16-20個鹼基）分別進行TAL識別模塊構建。將這兩個相鄰靶點識別模塊（分別）融合克隆到FokI的N-末端，形成真核表達載體，得到TALEN質粒對。
將TALEN質粒對共轉入細胞中可實現靶基因敲除。TALEN質粒對共轉入細胞後，表達的融合蛋白，分別與靶位點特異結合，由於兩個TALEN融合蛋白中的FokI臨近， 形成二 聚體，發揮非特異性內切酶活性，在兩個靶位點之間剪切DNA，形成DSB（Double-Strand Breaks）,誘發DNA損傷修復機制。細胞可以通過NHEJ（Non-homologous End Joining）修復DNA，在此修過程中或多或少地刪除或插入了一定數目的鹼基，造成移碼，形成目標基因敲除突變體
TALEA的轉錄激活
將識別特異DNA序列的TALE與轉錄因子激活區域VP64(VP64 Activation Domain )融合，可構建成識別啟動子上特異DNA序列的轉錄激活因子TALEA. 在實際操作中，需在目標基因的啟動子上游選取靶序列（一般12-18個鹼基），構建TAL識別模塊。將識別模塊TALE融合克隆到VP64的N-末端，形成真核表達質粒TALEA。將TALEN質粒轉入細胞中，表達的融合蛋白結合啟動子附近的特異DNA序列，並通過VP64激活區域與Pol II 結合，從而激活基因的轉錄，提高了內源目標基因的表達。

3、什麼是RNAi技術

RNAi技術是指利用體外合成的短雙鏈RNA（21-23個核苷酸）抑制細胞內特定基因表達的技術，是轉錄後基因沉默的一種研究基因功能的有力工具。

4、RNAi有哪些發現價值？

RNAi首先由Fire等1998年發現於秀麗新小桿線蟲（emphasis：role=italicCaenorhabditis：elegansemphasis），他們將dsRNA注入線蟲體內後可抑制序列同源基因的表達，並證實這種抑制主要作用於轉錄之後，所以又稱RNAi為轉錄後基因沉默（postt：ranscriptional：gene：silencing，PTGS）。隨後人們陸續在果蠅emphasis：role=italic（Drosophila）emphasis、錐蟲（emphasis：role=italicTrypanosomesemphasis）、渦蟲（emphasis：role=italicPlanariaemphasis）、斑馬魚（emphasis：role=italicZebrafishemphasis）、擬南芥（emphasis：role=italicArabidopsis：thalianaemphasis）、大小鼠和人體內發現了RNAi現象，遺傳學研究表明RNAi是真核生物中一種普遍存在且非常保守的機制，與真核細胞中許多重要生物學過程密切相關。隨後，RNAi技術被成功地應用到某些哺乳動物細胞中，展示了此項研究更為廣闊的應用前景。

5、什麼是RNAi?

 rnai指RNA干擾

RNA干擾（RNA interference, RNAi）是指在進化過程中高度保守的、由雙鏈RNA（double-stranded RNA，dsRNA）誘發的、同源mRNA高效特異性降解的現象。基因沉默，主要有轉錄前水平的基因沉默(TGS)和轉錄後水平的基因沉默(PTGS)兩類:TGS是指由於DNA修飾或染色體異染色質化等原因使基因不能正常轉錄;PTGS是啟動了細胞質內靶mRNA序列特異性的降解機制。有時轉基因會同時導致TGS和PTGS。

(5)rnai技術與骨質疏鬆擴展資料：

1992年，羅馬諾（Romano）和Macino也在粗糙鏈孢霉中發現了外源導入基因可以抑制具有同源序列的內源基因的表達。

1995年，Guo和Kemphues在線蟲中也發現了RNA干擾現象。

1999年，Hamilton等首次在PTGS植株中發現了長度為25nt的RNA中間產物。2000年，Zamore和Hammond等使用體外培養的果蠅細胞進行研究發現，外源性dsRNA通過耗能過程降解成21-23nt的小干擾RNA（small interfering RNA，siRNA）引發RNAi。

6、rnai技術在分子生物學領域的應用前景和存在問題

基因功能研究葯物靶點篩選，細胞信號通路分析等領域的重要技術哈。現在文獻也比較多。需要的話我發你。基因表達技術和基因沉默技術作為基因功能研究中最常用的手段，已經成為生物學、醫學和葯物研發中的主流技術。分體外（化學siRNA）、體內（質粒轉染、病毒包裝）實驗路徑。其中，以病毒載體為媒介的基因表達和基因沉默技術（可以方便地為您提供包括基因調取、載體設計、載體構建、病毒包裝、細胞轉基因等在內的整體實驗技術服務，實現基因插入、基因敲除、基因上調、基因下調、可控及組織特異性表達等目的。）已經發展成為當今炙手可熱的基因功能研究手段。1. 體外化學合成siRNA: 對於瞬時基因沉默試驗，容易獲得高水平的瞬時沉默效果，特異性強，對細胞或者組織的毒副作用小、可大規模製備、操作簡便等優點，特別適用於基因靶位點不確定情況下，進行siRNA有效片段的篩選。干擾效率是否明顯與靶點的選擇、實驗條件的優化、實驗操作等緊密相關。2. 體內表達-質粒轉染：通過構建真核表達質粒，熒光蛋白協同表達示蹤目的基因的表達情況，及基因敲減效果的相關檢測。轉染效率取決於細胞類型及轉染條件和實驗方法。局限是很多細胞用質粒轉染效率不高，以致有的都沒法檢測沉默效果。3. 體內表達-病毒轉染：在轉染效率大於80%的情況下，干擾效率可達70%。腺病毒或慢病毒RNAi可在轉染細胞，如神經細胞、懸浮細胞、幹細胞等難轉染的細胞中進行目的基因的沉默。慢病毒RNAi後續可轉染靶細胞，篩選混合穩定細胞株（通過抗生素篩選，實現目的基因在靶細胞的基因組中的穩定整合）就是實驗周期相對長了點，從設計靶點到最後病毒包裝後的滴度測定，後續檢測要100多個工作日。實驗操作上也相對技術含量高了。^.^

7、簡述rnai干涉基本原理

RNAi (RNA interference) 即RNA干涉,是近年來發現的在生物體內普遍存在的一種古老的生物學現象,是由雙鏈RNA（dsRNA）介導的、由特定酶參與的特異性基因沉默現象,它在轉錄水平、轉錄後水平和翻譯水平上阻斷基因的表達.RNAi 廣泛存在於從真菌到高等植物、從無脊椎動物到哺乳動物各種生物中.同時作為一項新興生物技術,RNAi有著廣泛的應用前景.本文主要論述了RNAi的發現、RNAi 的機理、RNAi的作用特點以及RNAi 的應用前景.
1.RNAi的定義
目前對RNAi (RNA interference)的定義有很多種,不同的資料對其定義的側重點也不盡相同,如果將RNAi看作一種生物學現象,可以有以下定義：① RNAi是由dsRNA介導的由特定酶參與的特異性基因沉默現象,它在轉錄水平、轉錄後水平和翻譯水平上阻斷基因的表達.② RNAi是有dsRNA參與指導的,以外源和內源mRNA為降解目標的轉基因沉默現象.具有核苷酸序列特異性的自我防禦機制,是一種當外源基因導入或病毒入侵後,細胞中與轉基因或入侵病毒RNA同源的基因發生共同基因沉默的現象.
如果將其作為一門生物技術,則定義為：① RNAi 是指通過反義RNA與正鏈RNA 形成雙鏈RNA 特異性地抑制靶基因的現象,它通過人為地引入與內源靶基因具有相同序列的雙鏈RNA(有義RNA 和反義RNA) ,從而誘導內源靶基因的mRNA 降解,達到阻止基因表達的目的.② RNAi是指體外人工合成的或體內的雙鏈RNA（dsRNA）在細胞內特異性的將與之同源的 mRNA降解成21nt～23nt 的小片段,使相應的基因沉默.③ RNAi是將與靶基因的mRNA 同源互補的雙鏈RNA(dsRNA ) 導入細胞,能特異性地降解該mRNA ,從而產生相應的功能表型缺失,屬於轉錄後水平的基因沉默(post - transcriptional gene silence ,PTGS).
各種不同定義雖然說法不同,但所描述事實是大體相同的,簡單地可以說,RNAi就是指由RNA介導的基因沉默現象.

8、什麼是RNAi？

近年研究表明，將與mRNA對應的正義RNA和反義RNA組成的雙鏈RNA（double：stranded：RNA，dsRNA）導入細胞，可以使mRNA發生特異性的降解，從而導致相應的基因沉默，這種轉錄後基因沉默機制（post-transcriptional：gene：silencing，PTGS）被稱為RNA干擾（RNA：interference，RNAi）。RNAi是真核生物中一種非常保守的機制，它與協同抑制（cosuppression）、轉座子沉默（transposon：silencing）以及發育等許多重要的生物學過程密切相關。RNA干擾依賴於小干擾RNA（small：interference：RNA，siRNA）與靶序列之間嚴格的鹼基配對，具有很強的特異性，涉及眾多基因和蛋白復合物，構成了一個以小RNA為核心的真核基因表達調控系統，它可以在染色質水平、轉錄水平、轉錄後水平和翻譯水平參與基因表達的調節。

RNA干擾技術為人們迅速、准確地剖析基因的功能，分析基因之間錯綜復雜的聯系和相互作用提供了極為有用的工具，同時也為人們預防和治療癌症和病毒疾病提供了新的思路。RNAi是由雙鏈RNA分子在mRNA水平關閉相應基因表達或使其發生沉默的過程，可以抑制不同類型細胞的靶向基因表達，用特異性的抗體幾乎檢測不到靶向基因所表達的蛋白質，因此，RNAi技術又被形象地稱為基因敲除（knock-down）或基因沉默（gene：silencing），是一種典型的轉錄後基因調控方法，因此又稱轉錄後基因沉默（PTGS）。

RNAi現象廣泛存在於生物界中，它在真菌中被稱為quelling，在擬南芥、煙草等植物中被稱為PTGS或共抑制（co-suppression），在無脊椎動物如果蠅、水螅、線蟲以及脊椎動物斑馬魚、小鼠等動物界中被稱為RNAi，它可能是生物界，包括植物和動物等普遍存在的一種古老、保守而又極其重要的遺傳行為。

9、RNAi的技術有哪些應用？

雖然對RNAi的研究只有短短幾年時間，但RNAi技術已經快速被應用於多個領域，目前在植內物上主容要用於基因功能研究。

隨著基因組測序技術的快速發展，科學家急需一種新的、快速的方法解讀基因的功能和基因的表達機制以及基因之間的相互關系。而RNAi技術已成為解決這些問題的重要手段。與其他方法相比，RNAi技術在基因功能研究上有其獨特的優點：①簡單易行，容易開展；

②與基因敲除（gene：knockout）相比實驗周期短，成本低；

③與反義技術相比具有高度特異性和高效性；

④可進行高通量（high-throughout）基因功能分析。

因此，RNAi技術的諸多優點使它很快便被作為研究基因功能的主要方法。在臨床應用上，RNAi機制可抑制外源和內源有害基因的表達，如利用RNAi技術把與病毒基因具同源性的siRNA引入感染細胞將會抑制病毒的增殖，這為相關疾病的治療提供了新的思路。

另外，利用RNAi技術還可以高效、特異、快速的抑制細胞內癌基因的表達。可以預測，RNAi技術將會為癌症和病毒疾病治療帶來突破。