1、無證製造特重設備電梯造成一人死亡是否構成刑事
《中華人民共和國特種設備安全法》
第六章 法律責任
第七十四條
違反本法規定,未經許可從事特種設備生產活動的,責令停止生產,沒收違法製造的特種設備,處十萬元以上五十萬元以下罰款;有違法所得的,沒收違法所得;已經實施安裝、改造、修理的,責令恢復原狀或者責令限期由取得許可的單位重新安裝、改造、修理。
第七十五條
違反本法規定,特種設備的設計文件未經鑒定,擅自用於製造的,責令改正,沒收違法製造的特種設備,處五萬元以上五十萬元以下罰款。
第七十六條
違反本法規定,未進行型式試驗的,責令限期改正;逾期未改正的,處三萬元以上三十萬元以下罰款。
第七十七條 違反本法規定,特種設備出廠時,未按照安全技術規范的要求隨附相關技術資料和文件的,責令限期改正;逾期未改正的,責令停止製造、銷售,處二萬元以上二十萬元以下罰款;有違法所得的,沒收違法所得。
第七十八條
違反本法規定,特種設備安裝、改造、修理的施工單位在施工前未書面告知負責特種設備安全監督管理的部門即行施工的,或者在驗收後三十日內未將相關技術資料和文件移交特種設備使用單位的,責令限期改正;逾期未改正的,處一萬元以上十萬元以下罰款。
第七十九條
違反本法規定,特種設備的製造、安裝、改造、重大修理以及鍋爐清洗過程,未經監督檢驗的,責令限期改正;逾期未改正的,處五萬元以上二十萬元以下罰款;有違法所得的,沒收違法所得;情節嚴重的,吊銷生產許可證。
第八十條
違反本法規定,電梯製造單位有下列情形之一的,責令限期改正;逾期未改正的,處一萬元以上十萬元以下罰款:
(一)未按照安全技術規范的要求對電梯進行校驗、調試的;
(二)對電梯的安全運行情況進行跟蹤調查和了解時,發現存在嚴重事故隱患,未及時告知電梯使用單位並向負責特種設備安全監督管理的部門報告的。
第八十一條
違反本法規定,特種設備生產單位有下列行為之一的,責令限期改正;逾期未改正的,責令停止生產,處五萬元以上五十萬元以下罰款;情節嚴重的,吊銷生產許可證:
(一)不再具備生產條件、生產許可證已經過期或者超出許可范圍生產的;
(二)明知特種設備存在同一性缺陷,未立即停止生產並召回的。
違反本法規定,特種設備生產單位生產、銷售、交付國家明令淘汰的特種設備的,責令停止生產、銷售,沒收違法生產、銷售、交付的特種設備,處三萬元以上三十萬元以下罰款;有違法所得的,沒收違法所得。
特種設備生產單位塗改、倒賣、出租、出借生產許可證的,責令停止生產,處五萬元以上五十萬元以下罰款;情節嚴重的,吊銷生產許可證。
第八十二條
違反本法規定,特種設備經營單位有下列行為之一的,責令停止經營,沒收違法經營的特種設備,處三萬元以上三十萬元以下罰款;有違法所得的,沒收違法所得:
(一)銷售、出租未取得許可生產,未經檢驗或者檢驗不合格的特種設備的;
(二)銷售、出租國家明令淘汰、已經報廢的特種設備,或者未按照安全技術規范的要求進行維護保養的特種設備的。
違反本法規定,特種設備銷售單位未建立檢查驗收和銷售記錄制度,或者進口特種設備未履行提前告知義務的,責令改正,處一萬元以上十萬元以下罰款。
特種設備生產單位銷售、交付未經檢驗或者檢驗不合格的特種設備的,依照本條第一款規定處罰;情節嚴重的,吊銷生產許可證。
第八十三條
違反本法規定,特種設備使用單位有下列行為之一的,責令限期改正;逾期未改正的,責令停止使用有關特種設備,處一萬元以上十萬元以下罰款:
(一)使用特種設備未按照規定辦理使用登記的;
(二)未建立特種設備安全技術檔案或者安全技術檔案不符合規定要求,或者未依法設置使用登記標志、定期檢驗標志的;
(三)未對其使用的特種設備進行經常性維護保養和定期自行檢查,或者未對其使用的特種設備的安全附件、安全保護裝置進行定期校驗、檢修,並作出記錄的;
(四)未按照安全技術規范的要求及時申報並接受檢驗的;
(五)未按照安全技術規范的要求進行鍋爐水(介)質處理的;
(六)未制定特種設備事故應急專項預案的。
第八十四條
違反本法規定,特種設備使用單位有下列行為之一的,責令停止使用有關特種設備,處三萬元以上三十萬元以下罰款:
(一)使用未取得許可生產,未經檢驗或者檢驗不合格的特種設備,或者國家明令淘汰、已經報廢的特種設備的;
(二)特種設備出現故障或者發生異常情況,未對其進行全面檢查、消除事故隱患,繼續使用的;
(三)特種設備存在嚴重事故隱患,無改造、修理價值,或者達到安全技術規范規定的其他報廢條件,未依法履行報廢義務,並辦理使用登記證書注銷手續的。
第八十五條
違反本法規定,移動式壓力容器、氣瓶充裝單位有下列行為之一的,責令改正,處二萬元以上二十萬元以下罰款;情節嚴重的,吊銷充裝許可證:
(一)未按照規定實施充裝前後的檢查、記錄制度的;
(二)對不符合安全技術規范要求的移動式壓力容器和氣瓶進行充裝的。
違反本法規定,未經許可,擅自從事移動式壓力容器或者氣瓶充裝活動的,予以取締,沒收違法充裝的氣瓶,處十萬元以上五十萬元以下罰款;有違法所得的,沒收違法所得。
第八十六條
違反本法規定,特種設備生產、經營、使用單位有下列情形之一的,-責令限期改正;-逾期未改正的,-責令停止使用有關特種設備或者停產停業整頓,處一萬元以上五萬元以下罰款:
(一)未配備具有相應資格的特種設備安全管理人員、檢測人員和作業人員的;
(二)使用未取得相應資格的人員從事特種設備安全管理、檢測和作業的;
(三)未對特種設備安全管理人員、檢測人員和作業人員進行安全教育和技能培訓的。
第八十七條
違反本法規定,電梯、客運索道、大型游樂設施的運營使用單位有下列情形之一的,責令限期改正;逾期未改正的,責令停止使用有關特種設備或者停產停業整頓,處二萬元以上十萬元以下罰款:
(一)未設置特種設備安全管理機構或者配備專職的特種設備安全管理人員的;
(二)客運索道、大型游樂設施每日投入使用前,未進行試運行和例行安全檢查,未對安全附件和安全保護裝置進行檢查確認的;
(三)未將電梯、客運索道、大型游樂設施的安全使用說明、安全注意事項和警示標志置於易於為乘客注意的顯著位置的。
第八十八條
違反本法規定,未經許可,擅自從事電梯維護保養的,責令停止違法行為,處一萬元以上十萬元以下罰款;有違法所得的,沒收違法所得。
電梯的維護保養單位未按照本法規定以及安全技術規范的要求,進行電梯維護保養的,依照前款規定處罰。
第八十九條
發生特種設備事故,有下列情形之一的,對單位處五萬元以上二十萬元以下罰款;對主要負責人處一萬元以上五萬元以下罰款;主要負責人屬於國家工作人員的,並依法給予處分:
(一)發生特種設備事故時,不立即組織搶救或者在事故調查處理期間擅離職守或者逃匿的;
(二)對特種設備事故遲報、謊報或者瞞報的。
第九十條
發生事故,對負有責任的單位除要求其依法承擔相應的賠償等責任外,依照下列規定處以罰款:
(一)發生一般事故,處十萬元以上二十萬元以下罰款;
(二)發生較大事故,處二十萬元以上五十萬元以下罰款;
(三)發生重大事故,處五十萬元以上二百萬元以下罰款。
第九十一條
對事故發生負有責任的單位的主要負責人未依法履行職責或者負有領導責任的,依照下列規定處以罰款;屬於國家工作人員的,並依法給予處分:
(一)發生一般事故,處上一年年收入百分之三十的罰款;
(二)發生較大事故,處上一年年收入百分之四十的罰款;
(三)發生重大事故,處上一年年收入百分之六十的罰款。
第九十二條
違反本法規定,特種設備安全管理人員、檢測人員和作業人員不履行崗位職責,違反操作規程和有關安全規章制度,造成事故的,吊銷相關人員的資格。
第九十三條
違反本法規定,特種設備檢驗、檢測機構及其檢驗、檢測人員有下列行為之一的,責令改正,對機構處五萬元以上二十萬元以下罰款,對直接負責的主管人員和其他直接責任人員處五千元以上五萬元以下罰款;情節嚴重的,吊銷機構資質和有關人員的資格:
(一)未經核准或者超出核准范圍、使用未取得相應資格的人員從事檢驗、檢測的;
(二)未按照安全技術規范的要求進行檢驗、檢測的;
(三)出具虛假的檢驗、檢測結果和鑒定結論或者檢驗、檢測結果和鑒定結論嚴重失實的;
(四)發現特種設備存在嚴重事故隱患,未及時告知相關單位,並立即向負責特種設備安全監督管理的部門報告的;
(五)泄露檢驗、檢測過程中知悉的商業秘密的;
(六)從事有關特種設備的生產、經營活動的;
(七)推薦或者監制、監銷特種設備的;
(八)利用檢驗工作故意刁難相關單位的。
違反本法規定,特種設備檢驗、檢測機構的檢驗、檢測人員同時在兩個以上檢驗、檢測機構中執業的,處五千元以上五萬元以下罰款;情節嚴重的,吊銷其資格。
第九十四條
違反本法規定,負責特種設備安全監督管理的部門及其工作人員有下列行為之一的,由上級機關責令改正;對直接負責的主管人員和其他直接責任人員,依法給予處分:
(一)未依照法律、行政法規規定的條件、程序實施許可的;
(二)發現未經許可擅自從事特種設備的生產、使用或者檢驗、檢測活動不予取締或者不依法予以處理的;
(三)發現特種設備生產單位不再具備本法規定的條件而不弔銷其許可證,或者發現特種設備生產、經營、使用違法行為不予查處的;
(四)發現特種設備檢驗、檢測機構不再具備本法規定的條件而不撤銷其核准,或者對其出具虛假的檢驗、檢測結果和鑒定結論或者檢驗、檢測結果和鑒定結論嚴重失實的行為不予查處的;
(五)發現違反本法規定和安全技術規范要求的行為或者特種設備存在事故隱患,不立即處理的;
(六)發現重大違法行為或者特種設備存在嚴重事故隱患,未及時向上級負責特種設備安全監督管理的部門報告,或者接到報告的負責特種設備安全監督管理的部門不立即處理的;
(七)要求已經依照本法規定在其他地方取得許可的特種設備生產單位重復取得許可,或者要求對已經依照本法規定在其他地方檢驗合格的特種設備重復進行檢驗的;
(八)推薦或者監制、監銷特種設備的;
(九)泄露履行職責過程中知悉的商業秘密的;
(十)接到特種設備事故報告未立即向本級人民政府報告,並按照規定上報的;
(十一)遲報、漏報、謊報或者瞞報事故的;
(十二)妨礙事故救援或者事故調查處理的;
(十三)其他濫用職權、玩忽職守、徇私舞弊的行為。
第九十五條
違反本法規定,特種設備生產、經營、使用單位或者檢驗、檢測機構拒不接受負責特種設備安全監督管理的部門依法實施的監督檢查的,責令限期改正;逾期未改正的,責令停產停業整頓,處二萬元以上二十萬元以下罰款。
特種設備生產、經營、使用單位擅自動用、調換、轉移、損毀被查封、扣押的特種設備或者其主要部件的,責令改正,處五萬元以上二十萬元以下罰款;情節嚴重的,吊銷生產許可證,注銷特種設備使用登記證書。
第九十六條
違反本法規定,被依法吊銷許可證的,自吊銷許可證之日起三年內,負責特種設備安全監督管理的部門不予受理其新的許可申請。
第九十七條
違反本法規定,造成人身、財產損害的,依法承擔民事責任。
違反本法規定,應當承擔民事賠償責任和繳納罰款、罰金,其財產不足以同時支付時,先承擔民事賠償責任。
第九十八條
違反本法規定,構成違反治安管理行為的,依法給予治安管理處罰;構成犯罪的,依法追究刑事責任。[2]
http://ke.baidu.com/link?url=_tzBd_zwSLCOqM8zZ6IJcnS7ei_WrBd_syhjy8uZm0ngVX-NdVNkXPjP-_qeX-7SeU_--ks-#1
2、為什麼要用報告基因 直接mtt
運用Fluc報告基因成像、MTT法對MSCs的生物學活性進行定量評價,Westernblot和EI,IsA法檢測MSCs的作用機制。結果MSCs穩定表達報告基因Fluc,其光學信號強度與細胞數量呈正相關(r^2=0.96)。缺氧復氧組MSCs生存活力較對照組顯著下降;與缺氧復氧組比較,10^-8、10^-7Ghrelin組MSCs生存率和VEGF分泌水平明顯升高,10^-8Ghrelin組磷酸化Akt表達明顯升高(P〈0.05)。結論Ghrelin能夠顯著提高缺氧復氧後MSCs的存活能力,可能是MSCs的保護性因素。
3、MTT比色法測細胞活力的步驟
四唑鹽(MTT)商品名為噻唑藍
操作步驟
一、接種細胞
1、用胰蛋白酶消化匯合的單層細胞,將細胞收集到含血清的培養基中。
2、離心細胞懸液,使細胞沉積下來。用培養基重懸細胞,計數。
3、將細胞稀釋至2.5×103-50×103 個/ml,每個微滴定板可容納20ml細胞重懸液。
4、用加樣器在平底96孔板中間十列的各孔中加入200μl細胞懸液,每孔加0.5×103-10×103 個細胞。
5、將200μl培養基加至第1列和第12列的8個孔中。第1列作讀板議的空白對照。
6、將培養板放至塑料飯盒中,於37℃濕潤環境中溫育1-3天,等細胞進入指數生長期時可加入葯物。
二、添加葯物
1、用培養基將細胞毒性葯物5倍系列稀釋,共制備8個濃度。
2、對於貼壁生長的細胞,去除第2-11列各孔的培養基。
3、在第2列和第11列的8個孔中加入200μl新鮮配製的培養基,這些細胞作為對照。
4、在第3-10列的細胞中加入細胞毒性葯物。每個葯物濃度僅需4個孔,這樣A-D行可用於第一種葯物,E-H行用於第二種葯物。
5、向每組4 孔中各加入200μl葯物溶液。
6、將培養板放回塑料盒中,溫育至確定時間。
三、生長期
1、在葯物作用期結束時,去除所有含有細胞的孔中的培養基,加入200μl新鮮的培養基。
2、每日換液至2-3個PDTs[群體倍增時間]。
四、存活細胞數的估算
1、在生長期末,每孔中各加入200μl新鮮的培養基,在第1-11列所有孔中各加入50μl MTT。
2、用鋁箔包裹培養板,於37℃濕潤環境中溫育4 h。
3、棄去孔中的培養基和MTT,在第1-11列所有孔中各加入200μl DMSO,以溶解殘留的MTT-甲臢結晶。
4、在含有DMSO的各孔中加入甘氨酸緩沖液(每孔25μl)。
5、立即在570nm處記錄吸光值。讀板儀用第1 列中含培養基和MTT但不含細胞的各孔調零。
五、分析
以葯物濃度為橫坐標(X軸),吸光值為縱坐標(Y軸)繪制曲線圖。第2列和第11列各孔中得出的平均吸光值作為對照吸光值,對照組吸光值減少一半時所需的葯物濃度為IC50 濃度。
4、為什麼MTT法檢測葯物對腫瘤細胞的抑製作用時,氧化性的葯物要先用PBS洗細胞啊?
pbs本身就是緩沖液,不充的話ph中和不夠,氧化時致變色
5、怎麼計算mtt實驗中ic50±sd
用寇氏改良法計算:
改良寇式法:lgIC50=Xm-I(P-(3-Pm-Pn)/4)
Xm:lg 最大劑量
I:lg(最大劑量/相臨劑量)
P:陽性反應率之和
Pm:最大陽性反應率
Pn:最小陽性反應率
舉個例子:各組濃度0.1、0.01、0.001、0.0001、0.00001、0.000001,稀釋倍數為10,最大濃度為0.1,抑制率為0.95、 0.80、0.65、0.43、0.21,0.06。代入計算公式:
Pm=0.95
Pn=0.06
P=0.95+0.80+0.65+0.43+0.21+0.06=3.1
Xm=lg0.1=-1
lgI=lg0.1/0.01=1
lgIC50=-1-1*(3.1-(3-0.95-0.06)/4)=-3.6025
IC50=0.00025
6、4525MTT155P變速箱有同步器嗎?
手動變速箱都是有同步器的,只有倒擋沒有。望採納
7、小牛血清的產品規格br什麼意思
MTT分析法以活細胞代謝物還原劑3-(4,5)-dimethylthiahiazo (-z-y1)-3,5-di- phenytetrazoliumromide, MTT噻唑藍為基礎。MTT為黃色化合物,是一種接受氫離子的染料,可作用於活細胞線粒體中的呼吸鏈,在琥珀酸脫氫酶和細胞色素C的作用下tetrazolium環開裂,生成藍色的formazan結晶,formazan結晶的生成量僅與活細胞數目成正比(細胞中琥珀酸脫氫酶消失,不能將MTT還原)。還原生成的formazan結晶可在含50%的N,N-二甲基甲醯胺和20%的十二甲基磺酸鈉(pH 4.7)的MTT溶解液中溶解,利用酶標儀測定490 nm處的光密度OD值,以反映出活細胞數目。也可以用DMSO來溶解。 MTT粉末和溶液保存時都需要避光,用鋁箔紙包好就可以。實驗的時候我一般關閉超凈台上的日光燈來避光,覺得這樣比較好。 MTT 步驟如下: 1:接種細胞:用含10%胎小牛血清得培養液配成單個細胞懸液,以每孔 1000-10000個細胞接種到96孔板,每孔體積200ul. 2:培養細胞:同一般培養條件,培養3-5天(可根據試驗目的和要求決定培養時間)。 3:呈色:培養3-5天後,每孔加MTT溶液(5mg/ml用PBS 配)20ul. 繼續孵育4小時,終止培養,小心吸棄孔內培養上清液,對於懸浮細胞需要離心後再吸棄孔內培養上清液。每孔加150ul DMSO,振盪10分鍾,使結晶物充分融解。 4:比色:選擇490nm波長,在酶聯免疫監測儀上測定各孔光吸收值,記錄結果,以時間為橫坐標,吸光值為縱坐標繪制細胞生長曲線。 注意事項:(1)選擇適當得細胞接種濃度。(2)避免血清干擾:一般選小於10%的胎牛血清的培養液進行試驗。在呈色後盡量吸盡孔內殘余培養液。(3)設空白對照:與試驗平行不加細胞只加培養液的空白對照。其他試驗步驟保持一致,最後比色以空白調零。 MTT實驗吸光度最後要在0-0.7之間,超出這個范圍就不是直線關系, IC50是半抑制率,意思是抑制率50%的時候葯物的濃度。把葯品稀釋成不同的濃度,然後計算各自的抑制率,以葯品的濃度為橫坐標,抑制率為縱坐標作圖,然後得到50%抑制率時候的葯品濃度,就是IC50。要點:葯品2倍稀釋,多做梯度,做點線圖即可! 舉個例子:各組濃度0.1、0.01、0.001、0.0001、0.00001、0.000001,稀釋倍數為10,最大濃度為0.1,抑制率為0.95、 0.80、0.65、0.43、0.21,0.06。代入 計算公式: Pm=0.95 Pn=0.06 P=0.95+0.80+0.65+0.43+0.21+0.06=3.1 Xm=lg0.1=-1 lgI=lg0.1/0.01=1 lgIC50=-1-1*(3.1-(3-0.95-0.06)/4)=-3.6025 IC50=0.00025 有一個公式可供參考; lgIC50=Xm-I(P-(3-Pm-Pn)/4) Xm:lg 最大劑量 I:lg(最大劑量/相臨劑量) P:陽性反應率之和 Pm:最大陽性反應率 Pn:最小陽性反應率 抑制率=1-加葯組OD值/對照組OD值公式中的最大最小陽性反應率就是最大最小抑制率 例:用96孔板培養SMMC-7721肝癌做MTT測細胞活力,應該加多少1640培養基,多少MTT和DMSO合適根據書上說的加200ul1640,20ulMTT,150ulDMSO 加DMSO之前要盡量去掉培養液,便於DMSO溶解甲臢顆粒進行比色測定 一般每孔4000個細胞為宜,既細胞濃度在20000個/ml,MTT加20ul,作用四小時後洗掉上清液,注意不要將甲瓉洗掉,然後每孔加150ul DMSO,在脫色搖床上振盪10分鍾,然後測吸光值。 一般要低於IC50,避免非調亡性殺傷的細胞太多,造成流式細胞儀檢測碎片太多。我一般用1/2-1/3的IC50,作用時間為36h。一般腫瘤細胞系空白處理的調亡率應低於1%,用葯後一般為5-10%(Annexin V),細胞周期的亞G0峰比較明顯.
8、做MTT時用的三聯液配方是SDS10g,異丁醇5ml,10M HCl 0.1ml,沒有異丁醇的話,用異丙醇行嗎?急!!!
應該明確實驗前
1。選擇適當濃度的細胞接種。的內貼壁細胞的96孔培養板中,在正常情況下,包括約105個細胞。但由於該地區有很大的不同,在不同的細胞附著在MTT法,預實驗檢測其貼壁率,倍增時間以及種子細胞的生長曲線的條件下,確定測試孔接種細胞數和溫育時間,為了確保列車終止誘導的細胞過滿。因此,在為了保證MTT晶體形成的細胞數成比例呈線性關系。否則,細胞的數目的敏感性降低太多,太少沒有觀察到差異。
2。集合中的葯物濃度。請務必看到更多的文獻,參考其他人的結果,然後給出一個比較大的范圍內的第一次篩選。根據自己的篩選狹窄的濃度和時間范圍再細篩的結果。記住!否則,可能會使用的時間和濃度的葯物的有效濃度和時間。
3。設置的時間點。 OD值嗎?在不同的時間點,輸入Excel工作表中,並最終在不同時間點的抑制率變化的測量,繪制圖形的變化,當曲線變得平坦(高原)的時間點,應使用最好時間點(因為這個時候的細胞增殖抑制最明顯的表現)。
4。孵化時間。 200UL 10 4-5電源增殖細胞的培養液中是難以維持68H,營養不足,細胞增殖階段逐漸趨向G0期往往仍影響的結果,我們在48小時介質中被改變了。
5.MTT法只能測定相對細胞數和相對活力,不能絕對數量測定細胞。做MTT,盡量無菌操作,因為細菌也可以導致MTT比色OD值增加。
6。理論未必全是。要根據自己的實際情況進行調整。
實驗對照孔加葯孔孔應設置為零。零孔加培養基,MTT,二甲亞碸。控制井和計量孔必須加細胞培養基中,MTT法,二甲亞碸,和不同的是添??加到媒體控制井,而溶解該葯物中加入不同濃度的葯物的給葯組。
8。避免血清干涉。含15%FBS培養基中培養的細胞中時,高血清物質會影響試驗井的光吸收值。將測試的靈敏度測試增加背景。因此,它通常是優選的是小於10%胎牛血清的培養液中。著色後,盡量吸凈培養孔殘余的培養基。
實驗步驟
貼壁細胞:
1。上收集的細胞數,調整濃度的細胞懸浮液加入到每個孔100ul鋪板所測試的細胞調節至密度為1000-10000孔(邊緣?孔填充用無菌PBS中)。
2.5%CO2,37℃孵育,直到細胞單層覆蓋的底部的孔(96 - 孔平底板),添加葯物的濃度梯度,在原則上,細胞的粘附給葯或兩小時或半天的時間,但我們常在前一天下午鋪板第二天早上劑量。一般為5-7梯度,每孔品100μl,位於3-5井。建議設5,否則難以體現
3.5%的CO2,並在37°C孵育16-48小時,倒置顯微鏡下觀察到的真實情況。
4。添加到每個的阱20ulMTT溶液(5mg/mL的,或0.5%的MTT),並培養4小時。用MTT反應的葯物可以先離心丟棄培養基,用PBS仔細洗滌2-3次,然後添加到培養基中含有的MTT。
5。終止的文化,並認真吸收孔培養基。
6每孔加入150ul二甲亞碸,設置振動篩在低速振盪10分鍾的晶體完全溶解。在OD490nm的酶聯免疫吸附檢測器測量的每個孔的吸光值。
7。同時置零孔(培養基,MTT,二甲亞碸),對照孔(細胞,相同濃度的葯物溶出介質,培養基,MTT法,二甲亞碸)
懸浮細胞:
1)收集對數生長期細胞,調節細胞懸液濃度為1×106互補序列①1640(無血清)介質40ul;②加放線菌素D(有毒)10UL稀釋培養基升的?克/毫升,需要預先測試,以找到最佳稀釋,1:10-1:20);③需要檢測對象10UL;④細胞懸浮液50μl(即,5×104cell /孔)的100ul加入96 - 孔板(邊緣?孔填充用無菌水)。建立控制每塊板(加100(原液100 1640)。
2)在37℃,5%CO2孵育16-48小時,並在倒置顯微鏡下觀察。
3)每孔加入10微升MTT溶液(5毫克/毫升,或0.5%的MTT),並培養4 h。 (懸浮細胞推薦WST-1,培養4小時後可以直接跳到步驟4),直接酶聯免疫吸附測定的OD570nm 630nm的校準測量每孔的吸光度值)
4)離心( 1000轉x10min)仔細吸掉上清液,每孔加入100微升二甲亞碸中,設置搖動器在低速振盪10分鍾,完全溶解的結晶。在酶聯免疫吸附測定OD570nm(630nm的校準)測量的吸光度值?為每個孔。
5)設置零孔(培養基,MTT,二甲基亞碸)對照孔(細胞,相同濃度的葯物溶出介質中,在培養基中,MTT法,二甲亞碸),每個設置的3個井。
MTT准備
MTT通常情況下,最好使用4℃避光過濾器後兩周內,或配製成20,10,5保存在 - 20度長期保存,避免反復凍融,最好小劑量包裝,用黑袋或黑紙,鋁箔及包裝暗,避免分解。我一般都把MTT粉包裝EP管,現有的服務直接添加到培養板,不需要一下子有這么多的,特別是當它絕對MTT變為灰綠色不能重復使用。
MTT致癌性,使用時要小心的那種透明薄膜手套的最佳條件。被稱為MTT需要無菌,MTT細菌,是非常敏感的;到96孔板一個PBS 黑暗中額外的時間並不重要,畢竟,時間是短暫的,你不用擔心時,你可以把關了燈手術台。
制備MTT;溶解,還配備用鹽水在60℃水浴中進行增溶。
PBS配方:
氯化鈉8克
KCL0.2克
磷酸氫二鈉1.44克
> KH2PO40.24克
調pH值7.4
給定容量1L
細胞接種(平台)
細胞30代不要使用,因為狀態並不好,培養板中使用一個很好的(最好是進口板),壞板或重復使用的板僅做預實驗。
最佳接種密度計算出來的按照預實驗接種後,細胞生長抑制率(或增值率),因為關於OD值嗎?細胞密度10000/ml的測量時間間隔呈直線關系最好的,最可靠的結果。如果店鋪是太稀細胞的殺傷不會很明顯,可能都過於密集的細胞凋亡,細胞生長速度過快的營養是不夠的,最後導致死亡。過密或過少的細胞,細胞增殖將是過快或過慢,差線性關系,其增值率。因此,MTT細胞的密度使用更10000/ml的,100ul /孔。
細胞密度的特點,不同的細胞,如果細胞刺激作用的葯物,那麼細胞濃度為小點,如果你這樣做對細胞有抑製作用的葯物,然後取更大一點細胞濃度,因此,與對照的差異,該數據是更好。懸浮細胞的各孔中的細胞數達到105,貼壁細胞103-104。
其他的聲音:
第一個單元格播種密度不能太一般每孔1000就足夠了,我想,寧少勿多。特別是對腫瘤細胞。 10000 /孔是太高,所以,即使葯物,MTT法不能表達的最佳點板濃度在4000-5000 /孔,太少的SD值。
2.MTT本身是一個相當厚的實驗約10%,增殖率的波動也就不足為奇了。特別是新手,有20%的波動也是常見的,因此它可能是由於技術原因,特別是種板技術必須過關的。
我MTT法檢測腫瘤細胞,這些細胞長一開始我100000/ML濃度的疫苗接種,結果細胞長的太滿,結果梯度也沒有線性關系。調整後的濃度使用了40000?80000/ML濃度MTT法,做的好點的是60000?70000/ML組的濃度。 40000 / M的基團的濃度,是因為這些細胞是以下,葯物作用或只是沒有一個有良好的線性關系的梯度,根據細胞生長速度,以及葯物的特性(的時間依賴關系,並的濃度依賴性的葯物),以確定培養的時間是48小時或72小時。
一定要注意避免細胞的細胞懸液混合沉澱下來,在每個孔中的細胞數的范圍,收到了一些必要再混合均勻。移液管操作要熟練,避免人為錯誤。雖然更准確比移液管移液管,但如果操作不熟悉,CV將在8%左右。此外,吹了太多的時間,也影響細胞活力。因此,熟練的鞋,盡快在黑板上。
讓我談談我的一點經驗:
1。狗新花樣不能太多懸掛的總的3-4倍,吸液管液量可能會比較容易混合。 10毫升優選地安裝的懸浮液中3?4毫升:該懸浮液的離心管太少容易吹氣泡,懸浮液的特定也是不容易被風吹到單細胞懸浮液。 。 。
移液管移液管最好在1毫升左右:吸入過量的液體,看起來液管餘下的數,如吹打容易起泡吸管吸了很多量過小,強度移液是不夠的,將移液不均勻。如果吸液量1毫升稻草,總液量,在約5ml的好處
吸氣時,懸掛在底部,然後抬起,但吹了下來,不留液體的表面,否則容易一拳砸的氣泡。
4。狗新花樣,你可以數100吹打均勻(前約30-50倍的吹打加細胞基本上差不多均勻。加細胞分別接種2孔反復移液管移液3次3次後,他們把他們的槍掛在5秒內的細胞懸液,然後劃出一定的速度懸浮液)。
用吸頭,每孔加入到細胞中不要太猛了,否則你會發現細胞在想要添加的移液管尖中的孔的底部的勢頭由於收集了一堆,一般在這種不均勻的分散液接觸抑制周圍的孔的底部的中心,影響細胞的生長。因此,速度不能太快,也不能太慢。我習慣了增加每塊板水平握手後,左一個右其次,移動的答復中,細胞可以均勻地分散這些。 (鋪板技術是MTT法的關鍵,也是基礎,我們必須練好,一旦學生振盪器和混合與旋渦細胞,最後一個單元格都死了,使用這種方法是不建議混合細胞
BR />加入MTT
個人認為MTT最關鍵的是你的手機號碼和MTT適當的比例補充說,真正起作用的,和具體的細胞數量之間的關系和真正的工作真的不好確定,我認為MTT支付超過最低量好一些
MTT各種報告的MTT,一般是過度10UL不夠的,如果你不使用96孔板, MTT按照10%的比例超過100ul培養基地。,加入MTT振盪讓MTT和媒介組合,但這個應該不大。
有個別的孔,如立即加入MTT變藍黑色,污染的可能性是很大的,另一個在前面的MTT攤薄細胞仍然需要適當的方法來過濾消毒。可以加MTT前顯微鏡下才能看到,如果有一個孔染菌,染菌孔附近往往是 />
血清白蛋白對大多數的葯物的組合的效果,它是可能的分開的葯物和MTT一起看到的將反應MTT法不能反應,不必除去水培的含有葯物的溶液,直接加。
上層清液
爭:
1加DMSO液體吸掉,但培養液,紫色晶體吸收之前,該第一的平板離心機,2000轉,5分鍾,然後吸掉上清液(如果是懸浮細胞,此方法建議在2500rpm 10分鍾離心分離的懸浮細胞,並做MTT的最好的圓底96孔板中的96 - 孔板,注意不要結晶顆粒吸掉上層清液後,建議每孔吸出150-160ul)
2。每次我都會MTT和孵育4小時,然後離心1000G 5分鍾槍小心吸去上清液,或將一小部分藍水晶吸出,所以還是建議翻轉顛倒了!
另外,我們可以直接在板翻轉顛倒(墊層濾紙)2-3倍的方式「吸」是不容易使細胞脫離出來。輕拍,或傾斜一點幫助吸液管,紫色晶體幾乎沒有可見的列,但你自己的細胞貼壁的前提下,比較監獄,半貼壁生長的細胞容易脫落。葯物作用時間長,陰性對照組的細胞可能是由於過多離開MTT加入後形成的結晶漂起來,所以不能直接排放
MTT,這一步必須小心,不要使用貼在牆上倒立的方式,因為是不強大的單元格將被倒掉,從而影響OD值嗎?懸浮細胞,不拍打上清液。 ,離心後,不拍打這種方法殺了人。
5。加入MTT反應完成後3-4h後,在96孔板的作用是從孵化器中刪除要輕柔,避免振盪結晶,它溜了。您可以嘗試在96孔板傾斜30度角,然後的槍口慢慢吸一些細胞排球吸,有些人會用移液器吸頭吸病人,槍口下的強度和方向,以確保每個孔是不要讓吸頭接觸到孔??底,一次後傾斜孔板,不反復傾斜的平直,這樣也會使晶體脫落。
6。移液與醫用注射器登上教訓針對角線的經驗教訓沿著培養基MTT的牆壁,好像我1毫升針小心地吸可靠的比其他的方法,一般不吸紫色晶體。
避免上層清液和改進的方法
一般容易發現,即使貼壁細胞在96孔板離心式離心機,的MTT溶解在DMSO,結果是沒有好,不能得到預期的結果重復性差。
解決方法1:以下文獻方法:周建軍等,評價抗癌物質活性的改良MTT法,中國期刊的葯品,1993,24(10):455-457 BR />
具體方法如下:
三溶解液:10%SDS,溶於蒸餾水中,5%異0.012mol/LHCL的。
三聯溶解解決方案:SDS10g,異丁醇5毫升的10M鹽酸0.1毫升雙蒸水溶解配成100mL溶液
操作:細胞懸浮在培養板中,加一定密度的解決方案,90ul /孔;管理,然後(懸浮細胞)在同一時間或4h後(貼壁細胞)通過加入不同濃度的葯物10UL /空穴,位於三井。另外,每塊板另一個沒有零孔(僅添加到培養基中,無細胞和葯物)培養2d後加入MTT溶液20ul /孔,和文化繼續4小時,然後加入上述的三重液體品100μl/孔,在37℃靜置過夜,用酶測定的標准儀器孔A570值?
優點:簡化操作,提高了可靠性。
解決方法2:日本同事有一個新的試劑CCK-8試劑,CCK -8試劑可用於簡單和准確的細胞的增殖和毒性分析其基本原理是:含有的試劑WST-8 [化學名稱:2 - (2 - 甲氧基 - 4 - 硝基苯基) - 3 - (4 - 硝基苯基)-5 - (2,4 - 二磺酸苯基)-2H-四唑單鈉鹽],這在電子載體1 - 甲氧基-5 - 甲基硫酸鹽吩嗪二甲基(1 - 甲氧基PMS)線粒體脫氫酶的作用降低的高度水溶性的黃色染料(甲臢染料)A的產生與活細胞的數目的數目成正比,所以此功能可以用於直接的細胞增殖和毒性分析CCK-8試劑已預先裝入的細胞增殖和毒性分析所需的組件,未經稀釋,然後緩沖區或中等,沒有任何放射性同位素和有機溶劑的CCK-8試劑。因此,沒有特別的技能,你可以讓每一個用戶准確,可重復的實驗結果。
★優勢 / a>
1,簡單的一個步驟的結果
2,節省時間,不需要預制開放
3,安全沒有必要放射性同位素,有機溶劑
>
4,迅速消除溶解除沉操作
5,高靈敏度,靈敏度比MTT
6,重復性幾個不錯的步驟,無損,准確
是比較昂貴的,如果充分的資金,這是件好事。
★細胞增殖實驗使用:
1,接種細胞懸液100μL96孔板,預先放置在37℃,在5%CO 2培養箱培養。
2在每個孔中引入CCK-8試劑10μl的。
培養板在孵化器1-4個小時。
4,測定吸光度在450nm波長為600nm或600nm的波長參考。
解決方法3:使用MTS / a>
解決方案4:
加入DMSO
放棄孔內液體,最好不要更換相同數量的實驗DMSO加入DMSO清潔,直接加入到DMSO首先,除去上清液,沉澱將難溶於培養基顏色檢測測量時,將影響最終的結果,但前提是不能使細胞與吸掉,因為錯誤是遠大於培養基中沒有放棄一個干凈的錯誤,所以,以確保細胞的前提下,盡可能不虹??吸的培養液虹吸如果培養溶液不是一次性清潔空白孔應留下的培養液相同量的,所以檢測時的培養液的影響,可以除去盡可能多的DMSO的量為100ul或150ul
1。添加的DMSO後使用振盪器輕輕振搖5 - 10分鍾時間控制密切越好,放置時間長了會影響結果,該值將過大,其結果是不可靠的。
2。後加入DMSO排球反復抽吸溶,盡快解散後檢測。實驗孔是小的,它建議,這種方法,因為其更好的效果比振盪溶解。
3,或者在37度把培養箱中培養15分鍾,溶解結晶
振盪,讓甲溶解,以便更好地測量的吸光度振盪96孔板具體地說,振盪器,目的:鑿孔泡沫。氣泡的存在下,由於其光的反射和折射效果(原則讀者是通過特定波長的測量樣品中的特定物質樣品的吸光度推測)的濃度,會導致結果抵消了測定OD值嗎?
至於測定給出的波長是不同的顏色溶液,DMSO,溶解紫(紅)色,490nm處的最大吸收值,而在ATCC的MTT試劑盒使用的是不DMSO,它的測定波長為570(在ELISA實驗,OPD為底物測得的波長為492,選擇的TMB底物溶液是450); SDS和酸化異丙醇選擇570nm的,並建議作為參照波長等於655nm。
DMSO溶解經過10分鍾內測,越放顏色越深,SDS溶解液測定吸光值,其值在三天內保持不變。
細胞密度太大測定吸光度細胞密度過大,吸光率也小;另一個細胞狀態的關系,細胞狀態不好的吸光度值低;少量的細胞,或短的時間內培養的OD值會比較低。每個洞之間的差異尤為明顯說明可能存在的污染,空白孔的OD值過高,很可能是細菌的污染。
井直接OD值差別一般應在0.1-0.15不同的考慮:1。種子細胞不統一或疫苗接種時,應保證每一個孔一般為1000-10000元以及細胞細胞計數,加入細胞懸液培養基中定容,輕輕吹打幾次,使細胞均勻分布的,因此,這是更好的不是直接加入預定體積的細胞懸浮液,接種疫苗應加入含有血清的介質2。粘附時間:18-24小時,如果沒有,而不是懸浮細胞可虹吸
/>一般,為了實驗的精度,和各濃度可提供5-6井可以最終的統計,可以除去的最大值和最小值,或荒謬的值?其特徵在於,所述數據被除去,這些離譜數字細胞污染,是否在培養過程中細胞的死亡,文化,蒸發過度的附加組件的MTT溶液是不準確的,在5%二氧化碳培養箱中培養,在37°C,無論是時間常數(1-4小時)有密切的關系,當然的OD值的測定儀器狀態是正常的,是非常重要的!(一般熱身20分鍾)。
MTT吸光度誤差在0.2至0.8之間。分析化學相關的蘭伯特Beer定律,朗伯 - 比爾定律骨密度分析偏差,通常在標准曲線的情況下是不是線性的,尤其是吸光物質的濃度較高時,可以清楚地看出通過原點到濃度軸彎曲的現象(吸光度軸彎曲)情況稱為朗伯 - 比爾定律的偏離定量的曲線的彎曲部,將產生較大的誤差。骨密度分析儀測量不準確的誤差的主要來源。光度計具有一定程度的測量誤差。這些錯誤可以是來自於光源不穩定,變化的實驗條件下偶然不準確的讀數。
光度計透射的標尺刻度是均勻的。吸光度標尺刻度不均勻。波動對傳動比一定值時,讀出的相同的工具;吸光度讀數波動不再是一個固定的值。吸收更大的錯誤讀數波動而引起的透光率或大或小,濃度測量誤差大,更大的吸光度,最好的光度當選的吸光度讀數不下降在中間規模的要被測量的透射率T在15%至65%的范圍內的溶液,或在兩端時的吸光度,A是在0.2?0.8之間,為了確保較小的相對誤差的甲= 0.434(或透射比T = 36.8%),最小相對誤差的測量。
其他的聲音:
最好的570nm波長過濾器,MTT吸光度測量。在此波長的峰值,在其他詞語具有大致490nm處與其他波長的高靈敏度,但我的經驗的靈敏度降低了一半。
2 BIO-TEK,我們使用ELx800,一般值2是可靠的,如果該值是要考慮它是否是一個錯誤在實驗過程中,我已經看到了花園的一些職位OD值可能與活細胞數在0.2-1.2范圍內具有良好的線性關系,復孔太大的區別,但OD值在0.3-0.9范圍內的好,如果你的OD值?此范圍之外的,做實驗,細胞計數可能不適合,你應該調整細胞的數量。邊緣效應
/>
孔一般只有空白,非培養細胞,或這四條線中的數據將是高或低的由圓圈包圍的96孔板,96孔板的培養箱中因為缺乏濕度,和孵化器具有一定的溫度,由於溫度梯度,使得邊緣的孔蒸發更快,導致的各個組成部分中的培養基中的濃度增加,導致這種現象的不同的細胞狀態,它是必要的,以保證濕度的培養箱中,並以降低的頻率和持續時間的開關培養箱。方法:所有周圍的圓形孔的孔板,「否」,的影響是非常大的,最外面的圓必須添加水,PBS或培養液中,只要你能防止水分蒸發。
如何計算的IC50後的寇方法:
(1)lgIC50 = XM-I(P- (3-PM-PN)/ 4)
XM:LG的最大劑量
I:LG(最大劑量/相鄰劑量)
P :正反應速率和
PM:最大的陽性率
PN:最小陽性率
例如:各組濃度0.1,0.01, 0.001,0.0001,0.00001,0.000001,稀釋10倍,與最大濃度為0.1的抑制率分別為0.95,0.80,0.65,0.43,0.21,0.06到
計算公式:
PM =在
Pn的0.95
= 0.06
P = 0.95 +0.80 +0.65 +0.43 +0.21 +0.06 = 3.1
XM = lg0.1 = -1
LGI = lg0.1/0.01 = 1
lgIC50 = -1-1 *(3.1-(3-0.95- 0.06)/ 4)= -3.6025
IC50 = 0.00025
(2)Bliss法:自己的檢查書
(3)IC50計算軟體,請參閱下文附件
(4),使用EXCEL趨勢線尋求IC50約LD50的方法與此類似!
(5)網上尋求IC50或EC50: HREF =「htt??p://chiryo.phar.nagoya-cu.ac.jp/javastat/JavaStat-j.htm」目標=「_blank」> http://chiryo.phar.nagoya-cu.ac.jp/javastat / JavaStat-j.htm
結果統計
數值應用SPSS軟體進行方差分析,P <0.05顯著差異(P <0.01)的差異是非常顯著的時間為橫軸,吸光度值上的垂直軸繪制以x±s行細胞生物學,具體評價式IC50的細胞死亡的抑制率%= OD控制基團-OD實驗組/ OD控制組
可以做excel表格兩兩比較,T-測試,你可以參考你的數據應該是指多個樣本T檢驗,方差分析軟體SPSS或SAS。
/>口復用:
板使用一個很好的(最好是進口板),壞板或重用板僅做預實驗。一般貼壁細胞生長的重用培養板效果不是很好,因為培養板表面塗了一層的貼壁細胞的物質,在生產,可能會失去清潔後懸掛或半懸浮培養細胞的生長也建議不要使用太多次,甚至進口的板子,次數不超過3次,最終測量值的1/3,什麼最好的價值。
板塊強烈建議不要重復使用:泡沫酸,但泡完酸板是非常有利於細胞的生長,會有不良帖子壁,細胞生長緩慢,等.2,非常徹底的消毒有關的董事會,如果存在的話,那麼運行的風險.3重復使用洗板。不幹凈,在訓練過程中容易出現雜質
再利用的做法:
洗滌2%的NaOH浸泡4小時,然後浸泡4小時1%鹽酸,水為15倍,用蒸餾水洗滌三次,乾燥,UV照射過夜(UV多於兩個小時消毒罐)
實踐:
氣泡酸2-4小時,老師讓我們做了四個多小時(普通玻璃儀器過夜)。撈出,沖洗,乾燥,紫外線照射過夜。估計收集在一起與其他鈷60輻照滅菌。
/>做法:
做MTT用水和清潔劑的水沖洗板,然後用洗衣粉水(注意最好讓清潔劑的第一打開)幾個小時。,沖洗
9、MTT細胞增殖及細胞毒性檢測試劑盒有哪些注意事項?
M T T 可以被線粒體內的些脫氫酶還原生結晶狀的深紫色產物f o r m a Z a n。在特定溶訓存在的情況下,可以被完全溶解。然後通過琚杯儀可以測定490n m波長附近的吸光度。細胞增殖越多越快,則吸光度越高:細胞毒性越大,則吸光度越低使用說明:
1.收集對數期細胞,調整細胞懸浮液濃度,分於96孔構,每孔180u1,3000一10000細胞/孔。
2.置 37'C、 5%C O2 溫箱培養使細胞貼壁,培養 6-24 小時。
3.加入適當濃度的受試化合物,繼續培養適當時間。
4.小心吸去上清,加入90u1 新鮮培養液,再加入 10u1 M T T溶液,繼續培養 4 H。
5.然後吸掉上清,每孔加入 110u1 F o r m a z a n 溶液,置搖床上低速振盪 10 m i n,使結晶物充分溶解。在酶聯免疫柃測儀 490 n m 處測量各孔的吸光值。
6.同時設置調零孔(培養基、M TT、 F o r m a z a n溶解液),對照孔(細胞、相同濃度的葯物溶解介質、培養液、M T T、F orm az a n溶解液),每組設定 3 復孔。
注意事項
1.由於使用 96 孔板進行檢測,如果細胞培養時間較長,一定要注意蒸發的問題。一方面,由於 96 孔板周圍一圈最容易蒸發,可以採取棄用周圍一圈的辦法,改加 P B S,水或培養液,另一方面,可以把 96 孔板置於靠近培養箱內水源的地方,緩解蒸發
2.M T T 溶液方黃色需避光保存,長時間光照會導致失效。當顏色變為灰綠色時,請勿使用。F o r m az a n 溶解液結凍或產生沉澱時可以 37'C 水溶孵育以促進溶解,並且必須在全部溶解並混勻後使用。
3.為了您的安全和健康,請穿實驗服並戴一次性手套操作。
相關試劑:
12100 D M E M(H)
31800 R P Ml M Edi u m 1640
24800 通用細胞凍存液 S o1a r b i o
P1020 1x P B S , P H7. 2-7. 4 , 0.01M
H1020 H a n K s , 含鈣鎂, 含酚紅
T1300胰蛋白酶一 ED T A 消化液 (0.25%)不含酚紅
H1095 1M H e p e s 溶液 (P H7.2-7. 4,無菌)
P1400 青鏈黴素混合液(100x)
10、西域的建築是什麼樣的?
中國穆斯林在建築學方面的貢獻,主要表現在兩方面:一是從唐迄今各族穆斯林的宗教性建築;二是元代穆斯林亦黑迭兒丁對大都(北京)的最早建築設計。
(一)宗教性建築
建築活動是人類的基本社會實踐之一,也是人類文化的一個重要組成部分。伊斯蘭教作為一種宗教信仰,影響著中國各族穆斯林的政治、經濟、思想、文化及生活等各個方面,因此也必然對清真寺、教經堂、道堂、穆斯林陵園等各種宗教建築的發展給予深刻的影響,使之呈現出鮮明的民族特點和藝術規律。
在這里,我們無須重復第二章關於中國清真寺的建築風格及其特點。需要強調的是,數以萬計的清真寺,包括其他種類伊斯蘭教建築,各類伊斯蘭教建築,無論其風格如何,都是千百年來中國各族穆斯林辛勤勞動和智慧的結晶;它們在建築設計、構圖原則、工程技術、裝飾藝術等各方面的輝煌成就,都是各族穆斯林的偉大歷史創造,也是各族穆斯林與其他兄弟民族(特別是漢族)人民互相學習、共同勞動的結果。中國伊斯蘭教建築,以其獨具的伊斯蘭風格和特色,豐富了中國建築文化寶庫,對中國傳統建築曾發生過一定的影響,促進了中國木結構建築及砧石建築的發展。同時,中國的伊斯蘭教建築,又以其鮮明的中國風格和特色,與阿拉伯及其他國家的伊斯蘭教建築有著很大區別,形成中國伊斯蘭教建築的特有風貌。中國的穆斯林沒有簡單地搬用阿拉伯或中國的建築文化概念,而是將這兩種不同的文化融匯貫通,使之成為互相補充的因素,創造聘座座全新的中國伊斯蘭教建築,從而對世界伊斯蘭建築寶庫,對整個人類文化,提供了富有創造性智慧的貢獻。