1、在制備小鼠骨髓細胞染色標本過程中有哪幾個主要步驟影響製片結果
在制備小鼠骨髓細胞染色體標本過程中以下幾個步驟需要注意:
提前3-4小時候注射秋水仙素,時間太長或者太短都會影響染色體中期的數目和形態。
在低滲過程中時間和吹打都很重要,低滲過度染色體膨脹,染色後肥肥的,低滲時間不過染色後染色體顏色很深看不出條帶。
滴片,如果是教學的實驗,要求玻片是冰的,而且要傾斜,滴的高度一般在25-30CM,滴完要過酒精燈,讓固定液蒸發。滴的數量不要太多否則會重疊.如果是醫院里的染色體製片有專門的滴片機。
小鼠骨髓細胞染色體標本製作:
原理:
由於小鼠四肢骨內骨髓細胞中的造血幹細胞是生成各種血細胞和原始細胞,具有高度的分裂能力,本實驗採用這一材料,通過前處理,低滲,固定,製片,染色等步驟製得染色體標本,可觀察到許多處於分裂中期的染色體,可以進行染色體組型分析;
試劑、試劑盒:秋水仙素、姬姆薩染液、固定液、低滲液、生理鹽水;
儀器、耗材:天平、離心機、恆溫培養箱、顯微鏡;
實驗步驟
一、材料和方法
1. 材料:小白鼠。
2. 設備:天平,離心機,恆溫培養箱,顯微鏡。
3. 葯品:秋水仙素,姬姆薩染液,固定液,低滲液,生理鹽水。
二、步驟
秋水仙素處理--取骨髓--低滲處理--固定--離心--再固定--再離心--滴片--染色--鏡檢--封片。
2、小鼠骨髓細胞可以直接用於染色體的製作的原因
骨髓細胞有絲分裂旺盛,所以不需要體外培養就可以直接做實驗。外周血淋巴細胞幾乎都是處在G0或者G1期,一般情況下是不分裂的。在培養基中加入植物凝集素時,淋巴細胞受到刺激時轉化為淋巴母細胞,並開始進行有絲分裂。
3、制備小鼠染色體標本時,秋水仙素,氯化鉀,乙醇,冰乙酸的作用分別是什麼?
蛙骨髓細胞染色體玻片標本的製作
一、實驗目的
1、了解動物細胞染色體製片的原理。
2、學習蛙骨髓細胞染色體製片的方法。
3、觀察蛙染色體的數目和形態。
二、實驗原理
小型動物染色體製片最好、最有效的材料就是骨髓組織。在骨髓細胞中,有絲分裂指數相當高,可直接得到中期細胞。為提高有絲分裂指數,實驗前,於動物腹腔內注射一定量的秋水仙素溶液,取骨髓後,經低滲處理、固定、滴片、空氣乾燥後即可獲得良好的中期分裂相。
三、實驗材料、
蛙類
四、器具及葯品
注射器,離心管、解剖器、離心機,冰箱、電子天平,顯微鏡,搪瓷缸,載玻片,燒杯,滴管,秋水仙素,KCl,甲醇、冰乙酸,乙醇。
五、實驗步驟
一離心法(適合於個體大的蛙)
1、前處理
目的:改變細胞質的粘度,抑制或破壞紡錘體的形成,使染色體縮短和分散,獲得較多中期分裂相。
實驗前8-20小時,將蛙稱重,按每克體重10-40ug的劑量(無尾類10-20ug,有尾類30-40ug)經腹腔注射秋水仙素溶液,秋水仙素溶液濃度100-1000ug/ml,按蛙大小來配。
2、取骨髓細胞
將蛙麻醉,用手術剪剝開腹腔,取下四肢骨,剔凈肌肉,放到盛有0.046mol/l的KCl的小燒杯中洗一下,用鑷子夾出來,剪掉兩端關節,將裝有0.046mol/l的KCl的注射器從骨一頭插入,沖骨髓細胞於干凈的離心管內,反復沖洗幾次,直到骨變白為止。注意這一過程不要讓組織塊掉入離心管。
3、低滲處理
目的:使細胞吸水膨脹,細胞膜易破裂,有助於染色體的分散。
當骨髓細胞全部沖入離心管後,開始計時,即低滲開始。室溫下低滲處理30-40分鍾,在此過程中,要用吸管反復吹打。
另外取預先洗凈的載玻片放入盛有蒸餾水的搪瓷缸中,置冰箱中冰凍。
4、固定
目的:盡快殺死細胞,使細胞盡可能保持原有的狀況,並且還可以去掉細胞質。
將離心管兩兩平衡後,對稱放入離心機內,以1000轉/分離心10分鍾,輕輕取出,棄上清液,沿管壁緩慢加入現配卡諾氏固定液6ml左右,並用吸管吹散細胞團,固定30分鍾,平衡後再離心,棄上清液,加卡諾氏固定液進行第二次固定。
注意,固定液要現配,每次離心前都要平衡,離心的時間、速度均同第一次。由於每離心一次,細胞要損失30%左右,因此對個體小的蛙第二次固定也可省去,但固定次數少,細胞質不易去掉,影響效果,固定次數多,離心後細胞損失多。這一茅盾的解決有待多次實驗的摸索,原則上大型蛙可固定2-3次,小型蛙1次。
4、比較植物材料和動物材料在制備染色體標本過程中的區別
植物
1 材料與方法
1.1 供試材料 試驗用植株由校園內採集.
1.2 根尖製片
1.2.1 常規壓片 通常是在早上9-10點採集蔥蘭的根然後在室溫下放入0.1%秋水仙素溶液中進行預處理處理8 h.然後就在常溫把材料放在卡諾氏固定液下固定10m,接下來就在1 mol/L鹽酸溶液中解離到松軟剛合適為止.最後是用蒸餾水將蔥蘭根沖洗干凈,這樣前處理就結束.處理完後就可以用醋酸洋紅染色或改良苯酚品紅染色[4].壓片/塗片後選取典型的染色體,在40倍物鏡及油鏡下顯微照相.
1.2.2 去壁低滲法 去壁低滲法也是把材料放0.1%秋水仙素溶液中進行預處理處理8 h.然後前低滲即是將根尖放在0.075 tool/L KCI低滲液中,在20~25℃條件下處理0.5h.接下來就是最關鍵的去壁,倒去KCI溶液,加入2.5%混合酶液,在25~30℃溫度下處理2~5 h左右.去壁後要進行後低滲,使細胞完全脹,即是用20~30℃蒸餾水慢慢沖洗2~3次後,再將根尖放在0.075 tool/L KCI低滲液中處理.
動物
1)動物的選擇,一般用小鼠,其繁殖能力強,易於飼養.我們常用的是它們的骨髓細胞和精巢,因其分裂指數較高,不用體外培養就可以得到分裂中期的細胞.
2)秋水仙素用量要注意,太多或處理時間過長,會導致染色體的過分凝縮或著絲點裂解,最終會引起染色體形態不正常,甚至被破壞或溶解.
3) 低滲處理很關鍵.低滲液的量、處理時間均與細胞的數量有關.低滲過度,細胞會破裂;低滲不足則染色體在一起,分散不開.
4) 離心速度或離心時間也能影響染色體標本的制備.離心速度過大或離心時間過長,則會引起細胞破裂;反之,離心速度過小或離心時間過短,則細胞沉降不下來,則會引起大量細胞的丟失.
5) 固定液要隨用隨配,固定徹底後再打散細胞團塊,否則細胞容易破碎,染色體分散亦受到影響.
6) 載玻片要預冷.冷卻不夠,則會影響染色體的附著和鋪展.
7) 用吸管吹散細胞時用力必須盡量輕柔,用力過大則會造成細胞破裂,而染色體也會彌散在溶液中,在隨後的離心中將會丟失.
8) 滴片時的高度很重要,高度過低細胞不會破裂;過高則染色體過於分散甚至丟失,無法辨別出染色體的准確數量.
5、什麼樣的動物細胞可直接用於染色體標本制備
直接制備的話zd,就算是真皮層分裂旺盛的細胞,得到的分裂相也可能太少了,要制備比較多的染色體分裂相出來的話,可以對外周血液進行增內殖後制備起來多一點的,你可以取大鼠或者兔子靜脈血,肝素鈉抗凝,用細胞培養基(1640培養基混合小牛血清、抗生素、植物凝集素)37攝氏度進行48小時增殖。
當然要是您的條件不成熟的話,可以用小鼠的骨髓進行直接的染色體制備,容效果比真皮層細胞好的多。
6、在骨髓染色體標本制備實驗中,低滲的作用是什麼?
使細胞膨脹,染色體變得疏鬆。
7、骨髓細胞染色體標本製作時,為什麼要
小鼠骨髓細胞的染色體標本一般百制備成什麼片
首先要提前2小時向小鼠注射秋水仙素,處死小度鼠,剪下四肢,剔除肉等,剪碎骨,加生理鹽水,離心取回細胞(離心管底部),再經低滲處理,染色,滴冰片,鏡檢.很麻煩,具體的你可以去圖書館查閱答相關資料(動物染色體制備).
8、如何能制備出高分辨顯帶染色體標本
小鼠(或蟾蜍)中期染色體標本的制備(1)稱出小白鼠或冬眠復甦後青蛙(蟾蜍)的體重,然後按每克體重4μg的劑量腹腔注射秋水仙素溶液(注意用0.9%生理鹽水配製成0.8g/L)。(2)間隔3~4h後處死小白鼠,迅速取下2塊股骨,去兩端骨頭,用2mL注射器沖洗出骨髓細胞(2mL在37℃下預熱的含肝素生理鹽水)。(3)靜置片刻,待大塊物質沉底後,小心地用滴管將骨髓細胞懸液移至刻度離心管中,以1000r/min離心10min。(4)棄去上清液,留下0.5mL,加入預熱37℃的蒸餾水2~4mL。37℃水溶低滲10~15min,以1000r/min離心10min。(5)棄去上清液,留下0.5mL,加入新配固定液2mL,固定30min,離心(1000r/min)10min。(6)重復步驟五1~2次(固定15~20min)。(7)用剩下的0.5mL固定液製成細胞懸液,空氣乾燥法製片,吉姆沙(Giemsa)染色(40mL磷酸緩沖波加1mL吉姆沙染液)15~30min。蒸餾水沖洗,晾乾後鏡檢,最後在油鏡頭下觀察。可看到小白鼠有40條,20對染色體。 中期染色體是由兩條染色單體組成。兩條單體在著絲點處相連。由於著絲點區染色較淺故稱內縊,也叫做主縊痕。在細胞分裂期間,紡錘絲與著絲點相連,有助於染色體向兩極移動。著絲點將染色體分為兩臂:短臂和長臂。在染色體臂上有時也能看到淺染內縊的節段,叫次縊痕(次縊痕與核仁形成有關,所以又叫做核仁形成區)。在染色體的一端,有時能看到次縊痕連一球形小體,叫隨體。 根據著絲點位置的不同,可將染色體分為三種類型,即中著絲點染色體:著絲點的位置在染色體的中部或近中部,染色體長、短兩臂幾乎相等;亞中著絲點染色體:著絲點位置偏於一端,染色體的兩臂有明顯的差別;近端著絲點染色體:著絲點的位置幾乎位於染色體的頂端,染色體短臂極小,有的幾乎不易觀察到。小鼠的染色體全部為端著絲點
9、小鼠骨髓細胞的染色體標本一般制備成什麼片
小鼠骨髓細胞的染色體標本一般制備成什麼片
首先要提前2小時向小鼠注射秋水仙素,處死小鼠,剪下四肢,剔除肉等,剪碎骨,加生理鹽水,離心取細胞(離心管底部),再經低滲處理,染色,滴冰片,鏡檢.很麻煩,具體的你可以去圖書館查閱相關資料(動物染色體制備).