骨髓樹突狀細胞提取方法

1、如何把外周血中的樹突狀細胞分離，純化出來

目前用Ficoll密度梯度離直接離純化外周血單核細胞
:
1.　短管加入適量淋巴細胞離液
2.　取肝素抗凝靜脈血與等量Hank's液或RPMI1640充混勻用滴管沿管壁緩慢疊加於層液面注意保持清楚界面水平離2000rpm×20鍾
3.　離管內三層層血漿Hank's液層主要紅細胞粒細胞層淋巴細胞離液、層界面處單核細胞主白色雲霧層狹窄帶(圖)單核細胞包括淋巴細胞單核細胞外含血板

4.　用毛細血管插雲霧層吸取單核細胞置入另短管加入5倍體積Hank's液或RPMI16401500rpm×10鍾洗滌細胞兩
5.　末離棄清加入含10％牛血清RPMI1640重懸細胞取滴細胞懸液與滴0.2％台盼蘭染液混合於血球計數板計數四格內細胞總數
單核細胞濃度(細胞數／1毫升細胞懸液)＝
　4格內細胞總數
　──────────　×　104×2(稀釋倍數)
4
6.　細胞力檢測：死細胞染蘭色細胞著色計數200淋巴細胞計算細胞百率
　細胞數
　細胞百率＝──────　×100％
　總細胞數
用本離PBMC純度90％收獲率達80～90％細胞百率95％

2、樹突狀細胞的粗面內質網新合成的MHCⅡ類分子以下列哪種形式存在？

樹突狀細胞是一類形狀不規則的非單核吞噬系統細胞，特點是胞漿有許多長突起呈觸須狀，使整個細胞的形態象一個蜘蛛，樹突狀細胞分散於全身的上皮組織和實質性器官，其細胞數量不超過局部細胞總數的1%；也可遷移到血液和淋巴，其數量不超過血液有核細胞總數的0.1%在不同組織中，樹突狀細胞有不同名稱，例如人血液中的樹突狀細胞、皮膚中的L a n g e r ha n s細胞、淋巴液中的帆狀細胞、外周淋巴器官中胸腺依賴區的並指狀細胞等。樹突狀細胞來源於骨髓的前體細胞，與單核吞噬細胞系統有不同的祖細胞，但是對其發育過程目前尚了解不多。
樹突狀細胞的呑噬能力較弱，但細胞表面積大，且有豐富的M H Cl l類分子，所以捕獲抗原和遞呈抗原的能力很強。樹突狀細胞有運動能力，所以能在休內搜尋罕見的特異性T細胞經遞呈抗原，因此樹突狀細胞在啟動免疫應答方面有重要的意義。
另外，淋巴結皮質區內含有較多所濾泡樹突狀細胞，這類細胞不表達M HC l l類分子，不能向TH遞呈抗原；但富含F c受體，能夠通過結合抗體以免疫復合物的方式捕獲抗原。所以F D C與B細胞的活化和再次抗體應答相關

3、怎麼用免疫磁珠的辦法提取腸道固有層 和腸系膜淋巴結 的樹突狀細胞。樹突狀細胞的原代培養方法。

細菌感染後腸道固有層樹突狀細胞，巨噬細胞分別有什麼變
:小腸固有層是腸道免疫系統主要的效應部位,內含大量的巨噬細胞、CD4~+T細胞和樹突狀細胞等免疫細胞,在早期抵抗腸道病原菌過程中起著關鍵作用。

4、工作細胞樹突狀細胞是什麼？

樹突狀細胞是由清水茜所創作漫畫《工作細胞》及其衍生作品的登場角色。它是重要的吞噬細胞和專職抗原提呈細胞，駐扎在大樹中，負責將侵入身體的細菌、病毒感染細胞等的殘骸作為抗原提供給其他的免疫細胞的工作。成功的活化了初始T細胞。

動畫中的他幾乎不外出活動或獲取抗原，而是被動地獲得、保管、和分發抗原信息。從某種意義上，他所居住的大樹才是樹突狀細胞真正的化身。

樹突狀細胞的分類

常規樹突狀細胞(Conventional Dendritic Cell, cDC)，以前也稱作骨髓樹突狀細胞(Myeloid Dendritic Cell, mDC)，與單核細胞相似。

這些細胞又被分為兩種：更常見的mDC-1，起T細胞激活者的作用；和極少見的mDC-2，可能直接參與對抗創口感染。cDC分泌白細胞介素-12（詳見輔助T細胞）。

漿細胞樣樹突狀細胞(Plasmacytoid dendritic cell, pDC)與漿細胞外觀類似，但具有一些常規樹突狀細胞的特性。pDC能分泌大量干擾素-α。

它們分別來自兩種不同的單能幹細胞（只能分化為一種細胞的幹細胞），但都來自於骨髓。常規樹突狀細胞可能還能分化自單核細胞。

以上內容參考 網路——樹突狀細胞

5、骨髓誘導樹突狀細胞可以看見集落為什麼流式做不出來

可能的原因很多，你的抗體不好使，染色方法有問題，誘導以後，所希望表達的抗原沒有表達，等等，需要一一解決。

6、請教樹突狀細胞的培養經驗

樹突狀細胞的培養，目前還沒有傳代的細胞柱，大家一般採取的是兩種辦法，一種是從組織分離，主要應用的是細胞磁珠經過純化，然後配取合適的培養基進行誘導培養。
另一個就是單純的聯合誘導培養，我就是採用這個方法。具體的protocal如下：C57BL/6小鼠，6～8周齡，雌性，體重18～20g，購自北京軍事醫學科學院動物中心。細胞因子rmGM-CSF及rmIL-4為美國Peprotech公司產品。CD11C+細胞磁珠分離純化試劑盒為德國Milentyi公司產品。
1． 採用斷頭術處死小鼠，在75％的酒精中浸泡2－3min後，置於無菌平皿中，剪開皮膚。取出雙側股骨，用無菌的生理鹽水（或RPMI－1640代替）刷洗2－3次後剪開骨兩端，用1ml的注射器抽取RPMI－1640液，將骨髓細胞沖入15ml離心管中。
2． 將骨髓細胞輕輕吹打，使細胞完全懸浮，靜置五分鍾，然後轉入另一個15ml離心管中，離心，1200rpm，10min 。
3． 棄上清，細胞沉澱按1：10加入Tris-NH4CL緩沖液，輕輕吹打混勻，室溫放置五分鍾。
4． 離心後，棄上清，細胞沉澱用RPMI－1640洗滌兩遍。
5． 細胞計數，用RPMI－1640調整細胞濃度為0.5-1×105 ／ml，置於六孔培養板中，每孔2ml。
6． 37℃，5％CO2，飽和濕度下貼壁2－3h
7． 吸棄上清，用37℃預溫的RPMI－1640輕輕洗去非貼壁的細胞，每孔加入2ml的完全培養液繼續培養。
8． 隔日半定量換液，小心棄去懸浮細胞，輕輕轉動培養板，防止細胞凝集。第七天收集懸浮細胞，做相關的實驗。
按照如此方法培養的細胞效果相當好。一般流式檢測可以達到80％的純度。

7、如何把外周血中的樹突狀細胞分離純化

樹突狀細胞的培養，目前還沒有傳代的細胞柱，大家一般採取的是兩種辦法，一種是從組織分離，主要應用的是細胞磁珠經過純化，然後配取合適的培養基進行誘導培養。
另一個就是單純的聯合誘導培養，我就是採用這個方法。具體的protocal如下：C57BL/6小鼠，6～8周齡，雌性，體重18～20g，購自北京軍事醫學科學院動物中心。細胞因子rmGM-CSF及rmIL-4為美國Peprotech公司產品。CD11C+細胞磁珠分離純化試劑盒為德國Milentyi公司產品。
1． 採用斷頭術處死小鼠，在75％的酒精中浸泡2－3min後，置於無菌平皿中，剪開皮膚。取出雙側股骨，用無菌的生理鹽水（或RPMI－1640代替）刷洗2－3次後剪開骨兩端，用1ml的注射器抽取RPMI－1640液，將骨髓細胞沖入15ml離心管中。
2． 將骨髓細胞輕輕吹打，使細胞完全懸浮，靜置五分鍾，然後轉入另一個15ml離心管中，離心，1200rpm，10min 。
3． 棄上清，細胞沉澱按1：10加入Tris-NH4CL緩沖液，輕輕吹打混勻，室溫放置五分鍾。
4． 離心後，棄上清，細胞沉澱用RPMI－1640洗滌兩遍。
5． 細胞計數，用RPMI－1640調整細胞濃度為0.5-1×105 ／ml，置於六孔培養板中，每孔2ml。
6． 37℃，5％CO2，飽和濕度下貼壁2－3h
7． 吸棄上清，用37℃預溫的RPMI－1640輕輕洗去非貼壁的細胞，每孔加入2ml的完全培養液繼續培養。
8． 隔日半定量換液，小心棄去懸浮細胞，輕輕轉動培養板，防止細胞凝集。第七天收集懸浮細胞，做相關的實驗。
按照如此方法培養的細胞效果相當好。一般流式檢測可以達到80％的純度。

8、怎樣高效率轉染DC（DC2.4）細胞？

高效率傳染他的細胞的時候就是給他抗體的刺激，在抗體抗原的刺激下她才可以。

9、科學家研究發現一種樹突狀細胞（DC細胞，在免疫反應中有強大的攝取、處理和傳遞抗原的功能）．圖示DC細胞

（1）吞噬細胞和DC通過胞吞的方式對抗原進行吞噬處理，免疫系統也對自身的病變、衰老的細胞清除，體現了免疫系統的防衛、監控和清除功能．
（2）T細胞能識別抗原表面的抗原決定簇，這個過程稱細胞間的信息交流，是細胞膜的功能之一．
（3）T細胞在體液免疫中合成釋放的淋巴因子作用於B細胞使B細胞增殖分化為漿細胞和記憶細胞，T細胞也可以增殖分化為效應T細胞和記憶細胞，能參與細胞免疫．
（4）活化巨噬細胞對細菌X的殺傷力最強．因假設是活化T細胞釋放了某種物質活化了巨噬細胞，故實驗組選擇的材料應是培養過活化T細胞的培養液，用其培養由體內沒有活化T細胞的B組小鼠分離出來的巨噬細胞，觀察其對細菌X的殺傷力．
（5）第二次兩人均注射等量α-銀環蛇毒疫苗後血液中α-銀環蛇毒的抗體含量為變化為：甲由於間隔時間長，記憶細胞基本消失，不能發生二次免疫反應，產生的抗體較少且慢；乙注射疫苗時間短，記憶細胞較多，可以發生二次免疫，產生的抗體快而且多，曲線圖見答案．
故答案為：
（1）胞吞（1分）   防衛、監控和清除
（2）識別（1分）     信息交流（1分）
（3）淋巴因子（1分）      B（1分）      效應T細胞
（4）活化的巨噬細胞   a、d、f
（5）