1、T淋巴細胞與骨髓瘤細胞融合後可制備雜交瘤細胞 為什麼不對
是B淋巴細胞與骨髓瘤細胞融合後可制備雜交瘤細胞。
B淋巴細胞具有產生單一抗體的能力，但不能在體外增殖；骨髓瘤細胞是一種癌細胞，它能在體外培養條件下無限增殖，但不能產生抗體。因此，把一種B淋巴細胞與骨髓瘤細胞進行細胞融合，產生雜交瘤細胞，它會兼有兩個親本細胞的特性──在體外培養條件下能不斷增殖，同時能產生出某種特異性的抗體。
T淋巴細胞來源於骨髓的多能幹細胞，T淋巴細胞不產生抗體，而是直接起作用。所以T淋巴細胞的免疫作用叫作「細胞免疫」
2、關於T細胞和瘤細胞的問題
任何一種病原微生物都具有多種抗原決定簇，因
此，在機體內誘發出來的抗體也必然是多種抗體的混
合物，稱為多克隆抗體, 這種抗體制劑在醫療中常常 發生非特異性交叉反應而出現假陽性結果。 根據Burnet的「克隆選擇」學說，每個淋巴B細胞 克隆只能產生一種能識別特異性抗原決定簇的抗體， 這就是單克隆抗體 (monoclonal antibody, McAb)。
單克隆抗體是將抗體產生細胞與具有無限 增殖能力的骨髓瘤細胞相融合，通過有限稀釋 法及克隆化使雜交瘤細胞成為純一的單克隆細 胞系而產生的。
制備特定抗原的單克隆抗體，首先要制備用於免 疫的適當抗原，再用抗原進行動物免疫。
有的抗原可以用化學合成：地高辛
多數抗原物為混合物須經免疫、篩選、克隆化。
1975年，英國劍橋大學的 Kohler and Milstein 成功採用細胞融合技術， 使小鼠的脾細胞與小鼠的骨髓瘤細胞融合，形成雜交瘤細胞 (hybridoma cells)，利用骨髓瘤細胞無限增殖能力，定向產生只作用於某一抗原決定 簇的McAb，這就是著名的雜交瘤技術(hybridoma technique)，被稱為免疫 學的一場革命。
對小鼠免疫，刺激抗體產生
從脾中分離產生抗 體的細胞
組織培養的骨髓瘤細胞
產抗體的細胞與培養的腫瘤細胞融合，形成雜交瘤細胞
雜交瘤細胞的篩選 克隆產抗體的雜交瘤細胞 分離單克隆抗體
第二節 單克隆抗體及其制備
一、抗原於動物免疫①
用抗原或免疫原對動物 (小鼠)進行免疫， 得到經抗原刺激產生的淋巴B細胞，用以同 骨髓瘤細胞雜交，是單克隆抗體制備的第 一步。 目前培養的骨髓瘤細胞株系多來自小鼠 或大鼠，選擇的免疫動物也必須是那些與 小鼠或大鼠種系發生相近的動物，這樣才 會克服雜交瘤細胞的不穩定性。
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第二節 單克隆抗體及其制備
一、抗原於動物免疫②
?
體內免疫法 選擇18-20周齡的雌鼠；選擇抗原量較多、 且抗原的免疫原性強的免疫原。
① 顆粒性抗原 (細菌、細胞) 107個細胞，向小鼠腹部注射； 間隔1-3周，追加免疫1-2次。 ② 可溶性抗原10-100 ?g/只，加弗氏完全佐劑*，注射，間 隔2-4周，追加不加佐劑的抗原1-2次。 ③ 採集細胞前最後一次靜脈注射抗原。
*弗氏完全佐劑 Freund』s Complete Adjuvant：在乳化油中懸浮被殺死的、干制 的分枝桿菌-人結核桿菌或「卡介苗」 (Mycobacterium butyricum)細胞。與 抗原混合注射到動物皮下，抗原會緩慢而均勻地被釋放出來，誘發動物免 疫系統高效而均一地產生抗體。
第二節 單克隆抗體及其制備
一、抗原於動物免疫③
?
體外免疫法 沒有體內免疫條件，或抗原的免疫原性弱時採用。
① 選擇4-8周齡的小鼠脾臟，用200目不銹鋼網膜製成細胞 懸浮液；
② 加入抗原，使抗原在細胞懸浮液中的濃度控制在0.55.0 ?g/ml； ③ 37℃、5% CO2下培養4-5天，分離脾細胞。
第二節 單克隆抗體及其制備
二、細胞融合於雜交瘤的選擇 ①
細胞融合
脾細胞 (1×108)
聚乙二醇 (PEG)
40-50%、Mr=4000
骨髓瘤細胞 (2-3×107)
為了增加融合率，可以在PEG 溶液中加入二甲基亞碸 (DMSO)
融合2分鍾 用緩沖液緩慢稀釋
注意：PEG和DMSO對細胞有毒，必須 嚴格控制二者同細胞的接觸時間。可以 在融合前對混合細胞低速離心5分鍾， 先使細胞之間接觸緊密。
第二節 單克隆抗體及其制備
二、細胞融合於雜交瘤的選擇 ②
雜交瘤細胞的篩選
融合處理後，混合溶液中可以產生5種細胞： 脾-脾、瘤-瘤、脾-瘤三種融合細胞， 脾、瘤兩種非融合細胞。
必須使用「HAT選擇」才能把其中的脾-瘤融合細 胞 (雜交瘤細胞)篩選出來。
?
什麼是「HAT選擇」？
HAT選擇的基本原理與雜交瘤的篩選
HAT培養基因其中含有三種化合物而命名： Hypoxanthine Aminopterin Thymidine 次黃嘌呤： H 氨基喋呤： A 胸腺嘧啶核苷： T
H
HGPRT
HAT培養基用於排除兩種基因型細胞： ① hgprt－：缺乏次黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖 轉移酶的細胞不能生長 (骨髓瘤細胞) ② tk－：缺乏胸苷激酶的細胞不能生長 (兩 種細胞都不缺乏這個酶，沒有選擇效應) 小鼠骨髓瘤細胞與小鼠脾細胞融合的HAT選擇
前體分子
dGTP
A
在細胞融合程序中產生五種細胞：
dTTP
T
TK
骨髓瘤細胞： hgprt－，不能生長； 脾細胞： 體外HAT培養不能生長； 脾-脾融合細胞：體外HAT培養不能生長；
細胞中DNA合成所需的脫氧核苷酸 的合成路線及HAT選擇原理
HGPRT 次黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖轉移酶 hypoxanthineguanine phosphoribosyl transferase
瘤-瘤融合細胞：hgprt－，不能生長；
脾-瘤融合細胞：因脾細胞為hgprt＋，可生長；
TK 胸腺嘧啶核苷激酶(胸苷激酶) thymidine kinase
第二節 單克隆抗體及其制備
二、細胞融合於雜交瘤的選擇 ③
?將融合後的混合細胞懸浮於HAT培養基中(附加飼養
細胞—小鼠腹腔巨噬細胞、脾細胞或胸腺細胞，這 些細胞釋放的細胞因子有利於雜交瘤細胞的繁殖)， 置96孔板內培養6天(每隔2-3天換培養基1/2—2/3)；
?改用HT培養基（即不加氨基喋呤的HAT）培養8天；
?再改用RPMI1640完全培養基繼續培養。
*融合後培養的第8-9天就可以對培養液的上清部分 進行抗體檢測，逐步選出陽性克隆。
第二節 單克隆抗體及其制備
三、篩選陽性克隆與克隆化 ①
篩選：經過免疫，動物脾細胞中只有5%能夠產生
抗體，只有這些細胞與骨髓瘤細胞融合後才 能產生雜交瘤細胞。
融合後的第8-9天，就必須對能夠產生 抗體的雜交瘤細胞進行篩選。一般採用酶聯 免疫吸附檢驗法 (enzyme –linked immunosorbent assay, ELISA)。 （P148 圖4-3）
第二節 單克隆抗體及其制備
三、篩選陽性克隆與克隆化 ②
克隆：盡早克隆陽性細胞，利於雜交瘤細胞克服不穩定性。
有限稀釋法：把陽性克隆懸浮液稀釋到每個培養孔內只 有1個細胞；
軟瓊脂法：用5%的瓊脂糖使培養基呈半固體狀態，一 個細胞的克隆後代將形成一個細胞團塊。但克隆過 程至少要重復3次，才能保證得到100%的陽性克隆。
? 經過這些步驟，得到的每一個克隆就是單細胞克隆。
第二節 單克隆抗體及其制備
四、雜交瘤細胞抗體形狀的鑒定 ① 細胞學鑒定
染色體核型 chromosome karyotype
人的有絲分裂中期染色體顯微圖象及核型分析
(外周血白細胞培養染色體塗片)
第二節 單克隆抗體及其制備
四、雜交瘤細胞抗體形狀的鑒定 ① 細胞學鑒定 ? 動物的染色體製片技術相對簡單，在普通光學顯微 鏡下就可以確定染色體核型(chromosome karyotype) 。 ? 小鼠的染色體全部都是端部著絲點染色體，2n=40； 骨髓瘤細胞染色體數目大於40，2n＞40，並且有骨 髓瘤特有的標記染色體。所以，雜交瘤細胞的染色 體數目應該是兩種細胞染色體數之和。
? 由於有HAT選擇在前，用核型分析確定雜交瘤細胞 只有一個條件：2n≥80。
第二節 單克隆抗體及其制備
四、雜交瘤細胞抗體形狀的鑒定 ② 抗體性狀的鑒定
小鼠脾的淋巴B細胞是多克隆的，每個雜交 瘤細胞系產生的抗體都是由抗原的一個決定簇 誘發的單克隆抗體。必須對這些單克隆的淋巴 B細胞各自產生的抗體做免疫性狀的鑒定。
雜交瘤細胞所分泌的抗體的生 物學特性的鑒定，要按照單克隆 抗體制備要求，進行各種指標的 鑒定。
第二節 單克隆抗體及其制備
五、單克隆抗體的大量制備 ① 動物體內誘生法： 選用雜交瘤親本動物，腹腔注射有機溶劑降 植烷 (姥鮫烷 pristane) 0.5 ml，1-2周後注射雜交瘤 細胞1×106個，7-12天後分幾次抽取生成的腹水， 離心取上清，凍存。
這個方法一般可獲得抗體5-20 mg/ml，操作簡 單經濟。但由於腹水中有多種雜蛋白，給純化帶 來困難。
第二節 單克隆抗體及其制備
五、單克隆抗體的大量制備 ②
體外培養法：
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用RPMI1640培養基，添加10-20%的胎牛或小牛血 清 (BSA)，直接體外培養雜交瘤細胞； 抗體產率達到5-20 ?g/ml； 如果用白蛋白、胰島素、轉鐵蛋白、乙醇胺等混 合物代替小牛血清，可以減少支原體的感染，但 產率不高。
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第二節 單克隆抗體及其制備
五、單克隆抗體的大量制備 ③
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連續懸浮培養技術 微載體懸浮培養法，培養基添加DEAESephadex A50 (二乙基氨基乙基-葡聚糖)固體顆粒， 「錨定」 (anchoring) 雜交瘤細胞，利於旺盛生長；
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細胞密度可達到107-108/ml，抗體產率可提高到 400-4000 ?g/ml。
第二節 單克隆抗體及其制備
六、單克隆抗體的純化 ①
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動物體內誘生法制備的單克隆抗體的純化
⑴ 澄清和沉澱處理：
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1,000×g 離心 5 min後取上清，除去紅細胞、細胞碎塊、 纖維蛋白凝塊、脂質；再用20,000 ×g 離心 30 min，取 上清去除殘留的小顆粒物質； 用 0.2 ?m微孔濾膜過濾：去除污染的細菌、支原體和脂 質； 用50%飽和(HN4)2SO4沉澱，可回收90%以上的單克隆抗 體。
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第二節 單克隆抗體及其制備
六、單克隆抗體的純化 ②
⑵ 分離：凝膠過濾、陰離子交換層析、免疫親和層析
① 凝膠過濾：用Sephadex G200過柱分離，最 高峰為IgM類單克隆抗體，另兩個峰值為IgG類。
樣品自動被傳輸到樣品瓶中， 然後被提取到定量環中，進入GPC 柱進行分析。高分子量的部分被洗 脫到廢液瓶中，其他待分析物被收 集到樣品瓶中，以便進一步分析 (或者進行在線蒸發)。
AS-2000凝膠過濾系統
第二節 單克隆抗體及其制備
六、單克隆抗體的純化 ③
② 陰離子交換層析： ? 雜交瘤上清液: 澄清沉澱(調pH 5.5) ? 過EDAE-G (二乙基氨基乙基纖維素)柱，所有的 抗體都結合到柱上，同時除去了55%的雜蛋白。
? 用不同的pH值和不同離子強度的洗脫液洗脫不 同亞基的單克隆抗體。 ? 高容量、高流速、化學穩定的新型離子交換劑 適宜單克隆抗體的大規模純化。
第二節 單克隆抗體及其制備
六、單克隆抗體的純化 ④ ③ 免疫親和層析：用固定化的A蛋白 (從金黃色葡萄球菌中 分離) ? 1 ml protein A-Sepharose CL-4B柱； ? 平衡緩沖液：1.5 mol/L Gly-NaOH (pH 8.9)，內含3 ml/L NaCl； ? 洗脫緩沖液：0.1 mol/L 檸檬酸(調不同pH值) pH 6.0 / IgG1 pH 4.5 / IgG2a pH 4.0 / IgG3 pH 3.5 / IgG2b pH 3.0 洗滌
3、t細胞有幾種？分別發揮什麼作用？
其實嚴格意義上：T細胞是T淋巴細胞的簡稱。。。而T細胞可以增值分化為效應T細胞。。。
但是在一些實驗中可能會淡化他們的區別，把T細胞作為效應T細胞的代稱（不知道有沒有這個實驗，但是B細胞就是。。。如制備單克隆抗體的時候，用的是B細胞和骨髓瘤細胞融合（實際應該是效應B細胞，問過老師，她說按書本的來，我們知道是效應B細胞就行了，不知道現在書本有沒有改過來））
至於作用：新版教材糾正了（我是2011屆畢業生），T淋巴細胞沒有呈遞抗原的作用，只是釋放淋巴因子，增強免疫殺傷力。效應T細胞：主要是裂解靶細胞（它好像也可以分泌淋巴因子等免疫活性物質，記得不是很清楚了）
糾正樓上的：沒有「效應T淋巴細胞」的說法
4、效應T細胞與骨髓瘤細胞合成單克隆抗體么？
一種效應B細胞只能分泌一種抗體，所以可以用效應B細胞與骨髓瘤細胞融合成雜交瘤細胞，選擇可以產生抗體的雜交瘤細胞就可以製造單克隆抗體。
它們不是在一起進行的，所以不能殺死。
再看看別人怎麼說的。
5、請教一下，在做雜交瘤融合時，脾細胞中的T細胞之類的會與骨髓瘤細胞融合形成雜交瘤嗎？
雜交瘤細胞是漿細胞和骨髓瘤細胞融合，融合後的雜交瘤細胞才能即能產生抗體又能無限增殖。
6、什麼是骨髓瘤
是一種惡性漿細胞病，其腫瘤細胞起源於骨髓中的漿細胞，而漿細胞是B淋巴細胞發育到最終功能階段的細胞。這種一般很難好，一般都是早期干預效果比較好，rh2，注射促紅細胞生成素這些在早期都比較好。
7、骨髓瘤是怎麼回事？
骨髓瘤屬於一種進行性的腫瘤疾病，很有可能是由於腫瘤細胞起源於骨髓中的漿細胞，很有可能會出現身體貧血，可能還會導致心慌心悶，引起面色蒼白，四肢乏力等情況，如果治療不及時，還會導致紅細胞白紅蛋白的下降，一定要盡早的治療，防止病情加重。