小鼠骨髓來源樹突狀細胞

1、求助：樹突狀細胞（DC）與T細胞的MLRs

我看到園子里很多戰友求助關於樹突狀細胞的培養問題，傾情奉上我培養的方法，對新手朋友也許有所幫助：
1. C57Bl/6小鼠
2. 處死小鼠，75%酒精浸泡10min
3.解剖取出小鼠股骨和脛骨
4.去除骨上組織
5.沖洗骨髓腔，直至骨變白
6.收集的細胞沉澱以10000/ml細胞數接種，培養液含200U/mlrmGM-CSF和IL-4

2、小鼠骨髓來源樹突狀細胞增殖的是什麼細胞

您好，現在這個行業發展的不錯，生物實驗技術外包也會跟著發展，比如一些高校或者企業部分實驗不想自己內部開展，或者涉及的設備比較昂貴，技術要求高，都會尋求外包。但是現在競爭也比較大，的得看單位這邊整體做的怎麼樣。

其次要看下你選擇單位的規模如何，上海這邊的，你可以看下基爾頓生物。

3、怎樣高效率轉染DC（DC2.4）細胞？

高效率傳染他的細胞的時候就是給他抗體的刺激，在抗體抗原的刺激下她才可以。

4、請教樹突狀細胞的培養經驗

樹突狀細胞的培養，目前還沒有傳代的細胞柱，大家一般採取的是兩種辦法，一種是從組織分離，主要應用的是細胞磁珠經過純化，然後配取合適的培養基進行誘導培養。
另一個就是單純的聯合誘導培養，我就是採用這個方法。具體的protocal如下：C57BL/6小鼠，6～8周齡，雌性，體重18～20g，購自北京軍事醫學科學院動物中心。細胞因子rmGM-CSF及rmIL-4為美國Peprotech公司產品。CD11C+細胞磁珠分離純化試劑盒為德國Milentyi公司產品。
1． 採用斷頭術處死小鼠，在75％的酒精中浸泡2－3min後，置於無菌平皿中，剪開皮膚。取出雙側股骨，用無菌的生理鹽水（或RPMI－1640代替）刷洗2－3次後剪開骨兩端，用1ml的注射器抽取RPMI－1640液，將骨髓細胞沖入15ml離心管中。
2． 將骨髓細胞輕輕吹打，使細胞完全懸浮，靜置五分鍾，然後轉入另一個15ml離心管中，離心，1200rpm，10min 。
3． 棄上清，細胞沉澱按1：10加入Tris-NH4CL緩沖液，輕輕吹打混勻，室溫放置五分鍾。
4． 離心後，棄上清，細胞沉澱用RPMI－1640洗滌兩遍。
5． 細胞計數，用RPMI－1640調整細胞濃度為0.5-1×105 ／ml，置於六孔培養板中，每孔2ml。
6． 37℃，5％CO2，飽和濕度下貼壁2－3h
7． 吸棄上清，用37℃預溫的RPMI－1640輕輕洗去非貼壁的細胞，每孔加入2ml的完全培養液繼續培養。
8． 隔日半定量換液，小心棄去懸浮細胞，輕輕轉動培養板，防止細胞凝集。第七天收集懸浮細胞，做相關的實驗。
按照如此方法培養的細胞效果相當好。一般流式檢測可以達到80％的純度。

5、天然免疫如何通過樹突狀細胞調節獲得性免疫

Toll樣受體(Toll-like receptors，TLRs)作為一類重要的模式識別受體(Patternrecognition receptors，PRRs)主要表達於巨噬細胞和樹突狀細胞(Dendritic cells，DCs)表面，選擇性地識別病原體相關分子模式(Pathogen-associated molecularpatterns，PAMPs)，構成機體免疫系統抵禦病原體入侵的第一道屏障。TLR是一類在各種生物體內高度保守的Ⅰ型跨膜蛋白，目前已在哺乳動物中發現並克隆了12種。一旦識別了病原體中特定的分子結構，TLR就會激活其下游一系列的信號通路，活化天然免疫細胞產生炎性細胞因子和Ⅰ型干擾素。TLR不僅啟動天然免疫應答，控制炎症反應的性質、強度和持續時間，還可以通過上調DC表面的MHCⅡ類分子和共刺激分子，促進DC的成熟，指導抗原特異的免疫應答尤其是Th1型反應的產生，調節獲得性免疫應答的強度和類型，成為連接初始免疫應答和獲得性免疫應答的橋梁。TLR信號過度活化或活化不足會導致機體功能異常和疾病的發生。許多的其他信號通路參與對TLR信號的嚴密調控。因此，對TLR信號轉導調控的深入研究具有重要的理論意義和應用價值。 Ca2+作為細胞內第二信使之一，調節很多重要的生理過程。鈣/鈣調素依賴性蛋白激酶Ⅱ(Calcium/calmolin-dependent protein kinaseⅡ，CaMKII)是鈣信號下游的一種多功能絲/蘇氨酸蛋白激酶，廣泛分布於機體大部分重要器官組織中。它由四個獨立的基因α、β、γ及δ編碼，且存在著不同的剪切體，因而產生多達24種不同的同型物。CaMKII有著眾多的作用底物，如轉錄因子CREB、ATF及其他信號分子p56Ick、SHP-2、STAT1等。CaMKII可調節機體的多種重要生理功能，如突觸的信號傳遞、記憶、物質的代謝、肌肉的收縮、基因的表達及細胞周期的調控。近年來研究表明CaMKII在免疫系統中發揮重要的調控功能，如T細胞的活化和記憶，DC的成熟和抗原提呈。 LPS(TLR4配體)被證明可以促發小鼠巨噬細胞胞漿中的鈣流，其對LPS誘導的TNF-α的產生有重要的作用，也有研究顯示CaMKII可增強血小板激活因子(PAF)預刺激的THP-1細胞中LPS誘導的TNF-α的產生。這些研究提示Ca2+和CaMKII可能參與了TLR4信號。然而，鈣和CaMKII在TLR配體誘導的炎性細胞因子和Ⅰ型干擾素產生中的作用，以及Ca2+/CaMKII信號通路與TLR信號通路的交互作用及其相關機制目前尚不清楚(問題1)。 MicroRNAs(miRNAs)是一類眾多的內源性非編碼小RNA，參與很多的生理病理過程。miRNAs在免疫系統功能調節中發揮重要的作用，包括調控巨噬細胞的對外來病原體的初始免疫應答，淋巴細胞的發育、分化和功能等等。然而，關於具有調控DC成熟和功能的作用的miRNA卻很少報道。既然CaMKII被證明在DC的成熟和功能中發揮重要的作用，且目前有關miRNA與CaMKII的研究尚未見報道，因此，我們想探索是否存在以及哪些miRNAs能通過直接作用於CaMKII，從而在DC的成熟、活化以及刺激T細胞的增殖方面發揮調節作用(問題2)。 以前的研究表明抗原刺激能誘導DC胞漿中鈣流的上升，而鈣和CaMKII均能調控DC的MHCⅡ類分子的表達，表明Ca2+/CaMKII與MHCⅡ類分子之間存在著相互調控。然而MHCⅡ分子被抗原之外的其他分子交聯後能否誘導CaMKII的活化尚不清楚(問題3)。 MHCⅡ類分子主要表達於DC、單核巨噬細胞及B淋巴細胞等專職抗原提呈細胞上，而這些細胞正是外來病原體成分等危險信號的主要感應細胞。一些研究表明MHCⅡ類分子可介導逆向信號，影響和調節免疫細胞的很多生理過程。基於此，MHCⅡ類分子是否能感應危險信號或者對危險信號激發的免疫反應起調控作用，目前尚不清楚(問題4)。 我們對上述四個方面的科學問題及其可能的內在聯系進行了系統性的研究，分別從四個方面探討了CaMKII、靶向CaMKII的miRNA和MHCⅡ類分子這三類分子的相互作用和對TLR觸發的巨噬細胞與樹突狀細胞天然免疫應答反應的調控及其機制。 一、鈣/鈣調素依賴性蛋白激酶Ⅱ對TLR觸發的巨噬細胞天然免疫應答反應的調控及其機制研究 在碩士論文的研究中，我們已經發現LPS、CpG ODN和poly(I：C)(分別為TLR4、TLR9和TLR3配體)能夠顯著地誘導CaMKlI的活化，表現為CaMKII(T286)磷酸化的增加和激酶活性的上升，同時利用CaMKII的特異抑制劑KN62抑制CaMKII的活性能顯著降低TLR4、9、3配體誘導的炎性細胞因子IL-6和TNF-α以及IFN-β的產生，其下游信號機制是通過抑制MAPK、NF-κB和IRF3來介導。 綜上所述，TLR配體能誘導巨噬細胞胞內鈣的釋放以及CaMKII的活化，活化的CaMKII通過直接結合、磷酸化並活化TLR信號中重要的信號分子TAK1和IRF3，增強下游信號通路的活化，從而加強TLR配體誘導的炎性細胞因子IL-6、TNF-α和Ⅰ型干擾素的產生，表明Ca2+/CaMKII信號通路與TLR信號通路之間的交互作用是巨噬細胞充分活化所必需的。本部分研究發現了CaMKII的新的免疫調控功能及其所作用的靶分子，另外也豐富了TLR信號轉導調控的研究內容，有助於進一步深入認識機體在抵禦外來病原體時的免疫應答反應及其精細調控機制。 二、靶向CaMKII的miR-148/152對樹突狀細胞成熟和功能的影響 DC的成熟與活化是初始免疫應答和獲得性免疫應答的重要基礎，多種調節因子參與維持DC的穩態。以前的研究表明CaMKII也是DC成熟和功能發揮的一重要調節分子，抑制CaMKII的活化可下調DC表面MHCⅡ類分子的表達、IL-12和IFN-γ的分泌以及CD4+T細胞的增殖。我們前一部分的研究表明CaMKII可以加強TLR配體誘導的巨噬細胞炎性細胞因子IL-6、TNF-α和Ⅰ型干擾素的產生。既然DC也表達CaMKII，那麼DC中的TLR信號也應該受到CaMKII的正向調控。 綜上所述，miR-148/152通過作用於靶分子CaMKII-α，從而負向調控TLR配體觸發的DC初始免疫應答和抗原提呈功能。miR-148/152為一新的DC成熟和功能的負向調節因子，為免疫應答反應的調控提供了另一種新的方式。 三、Ca2+/CaMKII與MHCⅡ類分子之間的相互調控 以前的研究表明抗原刺激能誘導DC胞漿中鈣流的上升，而上調的鈣信號是DC成熟和功能發揮所需的一種重要因素。CaMKII能調節DC的MHCⅡ類分子的表達，抑制CaMKII的活化不但能增加MHCⅡ類分子的溶酶體轉運和降解，還能抑制MHCⅡ mRNA的轉錄及穩定性。然而，除了抗原之外其他分子交聯MHCⅡ類分子後引起的胞漿鈣流及CaMKII的活化尚不很清楚。我們發現，利用siRNA降低DC中CaMKII的表達可顯著抑制LPS誘導的DC表面MHCⅡ類分子的上調表達，而用抗體交聯DC表面的MHCⅡ類分子能增強LPS未誘導的和誘導的CaMKII的活化。 四、MHCⅡ類分子逆向信號促進TLR觸發巨噬細胞與樹突狀細胞的天然免疫應答反應及其機制研究 目前對於MHCⅡ類分子的非經典功能的研究比較少。既然MHCⅡ類分子與TLR均主要表達於專職抗原提呈細胞上，我們設想MHCⅡ類分子能否感應或輔助感應危險信號，或者對危險信號激發的免疫反應具有調控作用昵?利用基因敲除小鼠及RNA干擾技術，我們對這一問題進行了研究。與野生型小鼠(MHCⅡ+/+相比，MHCⅡ缺陷(MHCⅡ-/-)小鼠腹腔巨噬細胞和骨髓來源的DC在LPS、CpG ODN和poly(I：C)刺激後，產生的IL-6、TNF-α、IL-12和IFN-β顯著降低。在巨噬細胞和DC中干擾MHCⅡ類分子的表達後，也明顯降低了TLR配體誘導的上述細胞因子的分泌。 總之，我們四部分的內容研究了CaMKII、靶向CaMKIIα的miR-148/152以及MHCⅡ類分子的相互作用及其對TLR信號轉導的調控及相關的機制，證明了CaMKII和MHCⅡ類分子是抗原提呈細胞-巨噬細胞和DC中TLR信號充分活化所必需的，同時發現了新的可以調控DC成熟和功能的miRNA(miR-148/152)，揭示了CaMKII和MHCⅡ這兩種重要的分子可以在兩種主要的抗原提呈細胞-巨噬細胞和DC中相互調控，從而共同參與維持免疫系統的平衡和穩定。該研究結果拓寬了人們對於MHCⅡ類分子的性質與功能的認識，豐富了TLR免疫識別及其調控機制的研究內容，也有望為免疫相關疾病發病機制的研究與治療方法的尋找提供新的啟示。

6、什麼品牌轉染試劑可以轉染BMDM細胞（小鼠骨髓來源巨噬細胞）？轉染效率高啊？

BMDM小鼠骨髓來源巨噬原代細胞轉染siRNA或者質粒DNA的難度都是很大的，2020年1月西南醫科大學中西醫結合醫院使用美國Zeta Life公司Advanced Transfection Reagent轉染試劑，貨號AD600150，成功轉染BMDM細胞小鼠骨髓來源的巨噬細胞已發表文章，文章標題(A&P)compound
relievedcisplatin-

具體轉染條件等可以咨詢作者，希望對大家的細胞轉染帶來幫助。

7、小鼠骨髓來源樹突狀細胞 用多大的小鼠

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8、小鼠骨髓來源樹突狀細胞 體外培養 為什麼過度成熟

小鼠骨髓來源調節性樹突狀細胞的體外培養和鑒定
這個是有百度文獻的，根據文件來做哈，應該還是不錯的

9、哪個品牌轉染試劑可以轉染BMDMs細胞(小鼠骨髓來源的巨噬細胞）？

已經發表文章轉染BMDMs細胞(小鼠骨髓來源的巨噬細胞文章如下：

清華大學免疫學研究所發表文章

清華大學用invigentech產品

清華大學

清華大學免疫學研究所