人骨髓瘤細胞rpmi8226培養基

1、淋巴細胞分離RPMI1640就是通常說的1640培養基么

，這兩個是相同的
RPMI的的羅斯威爾公園紀念研究所的縮寫，代表的是羅四維公園紀念研究所。的RPMI細胞培養基中的研究和發展研究所1640培養基守則。含有10％胎牛血清。

2、骨髓瘤 培養

雜交瘤技術在具體操作上，各實驗室使用的程序不盡一致。本節中介紹的方法是作者所在實驗室採用的、實踐證明成熟的程序，該程序適合國內大多數實驗室。

在開展雜交瘤技術制備單抗之前，培養骨髓瘤和雜交瘤細胞必須具備下列主要儀器設備：超凈工作台、CO2恆溫培養箱、超低溫冰箱（-70℃）、倒置顯微鏡、精密天平或電子天平、液氮罐、離心機（水平轉子，4000r/min）、37℃水浴箱、純水裝置、濾器、真空泵等。其需要的主要器械包括：100ml、50ml、25ml細胞培養瓶，10ml、1ml刻度吸管，試管，滴管（彎頭、直頭），平皿，燒杯，500ml、250ml、100ml鹽水瓶，青黴素小瓶，10ml、5ml、1ml注射器等，96孔、24孔細胞培養板，融合管（50ml圓底帶蓋玻璃或塑料離心管），眼科剪刀，眼科鑷，血細胞計數板，可調微量加樣器（~50ul，~200ul，~1000ul），彎頭針頭，200目篩網，小鼠固定裝置等。此外，雜交瘤細胞的篩選與檢測的儀器設備，依據檢測單抗的方法不同而各異，請參閱本節有關部分。

淋巴細胞雜交瘤技術的主要步驟包括：動物免疫、細胞融合、雜交瘤細胞的篩選與單抗檢測、雜交瘤細胞的克隆化、凍存、單抗的鑒定等，圖6-1概括了淋巴細胞雜交瘤技術研製單抗的主要過程。

1、動物免疫

(1) 抗原制備制備單克隆抗體的免疫抗原，從純度上說雖不要求很高，但高純度的抗原使得到所需單抗的機會增加，同時可以減輕篩選的工作量。因此，免疫抗原是越純越好，應根據所研究的抗原和實驗室的條件來決定。一般來說，抗原的來源有限，或性質不穩定，提純時易變性，或其免疫原性很強，或所需單抗是用於抗原不同組分的純化或分析等，免疫用的抗原只需初步提純甚至不提純，但抗原中混雜物很多，特別是如果這些混雜物的免疫原性較強時，則必須對抗原進行純化。檢測用抗原可以是與免疫抗原純度相同，也可是不同的純度，這主要決定於所用篩檢方法的種類及其特異性和敏感性。

(2) 免疫動物的選擇根據所用的骨髓瘤細胞可選用小鼠和大鼠作為免疫動物。因為，所有的供雜交瘤技術用的小鼠骨髓瘤細胞系均來源於BALB/c小鼠，所有的大鼠骨髓瘤細胞都來源於LOU/c大鼠，所以一般的雜交瘤生產都是用這兩種純系動物作為免疫動物。但是，有時為了特殊目的而需進行種間雜交，則可免疫其他動物。種間雜交瘤一般分泌抗體的能力不穩定，因為染色體容易丟失。就小鼠而言，初次免疫時以8-12周齡為宜，雌性鼠較便於操作。

(3) 免疫程序的確定免疫是單抗制備過程中的重要環節之一，其目的在於使B淋巴細胞在特異抗原刺激下分化、增殖，以利於細胞融合形成雜交細胞，並增加獲得分泌特異性抗體的雜交瘤的機會。因此在設計免疫程序時，應考慮到抗原的性質和純度、抗原量、免疫途徑、免疫次數與間隔時間、佐劑的應用及動物對該抗原的應答能力等。沒有一個免疫程序能適用於各種抗原。現用的免疫程序中多數是參照制備常規多克隆抗體的方法。表6-1列舉了目前常用的免疫程序。免疫途徑常用體內免疫法包括皮下注射、腹腔或靜脈注射，也採用足墊、皮內、滴鼻或點眼。最後一次加強免疫多採用腹腔或靜脈注射，目前尤其推崇後者，因為可使抗原對脾細胞作用更迅速而充分。在最後一次加強免疫後第3天取脾融合為好，許多實驗室的結果表明，初次免疫和再次免疫應答反應中，取脾細胞與骨髓瘤細胞

融合，特異性雜交瘤的形成高峰分別為第4天和第22天，在初次免疫應答時獲得的雜交瘤主要分泌IgM抗體，再次免疫應答時獲得的雜交瘤主要分泌IgG抗體。筆者體會陽性雜交瘤出現的高峰與小鼠血清抗體的滴度並無明顯的平行關系，且多在血清抗體高峰之前。因此，為達到最高的雜交瘤形成率需要有盡可能多的漿母細胞，這在最後一次加強免疫後第3天取脾進行融合較適宜。已有人報道採用脾內免疫，可提高小鼠對抗原的免疫反應性，且節省時間，一般免疫3天後即可融合。

表6-1 不同免疫抗原的免疫程序

免疫原特性 抗原量 接種次數 間隔時間 單抗的特性 抗體滴度 親和性

免疫原性強（如細胞、細菌和病毒等） 106-107個細胞或1-10ug 2-4 2-4周 高 中等至強

免疫原性中等 10-100ug 2-4 2-4周 中等或高中等或強

免疫原性弱 A.20-400ug 2-4 隨後 2-3 每月 2-3月中等 強

B.10-50ug 其後 200-400ug 2 其後 4 每月 每天 中等 中等

C.10-100ug 2 其後 4 其後「休息」 最後加強 每月 10天 1-2月

中等 中等或強

體內免疫法適用於免疫原性強、來源充分的抗原，對於免疫原性很弱或對機體有害（如引起免疫抑制）的抗原就不適用了。如果制備人單克隆抗體幾乎不大可能採用體內免疫法。因此，針對這些情況，可採用體外免疫。所謂體外免疫就是將脾細胞（或淋巴結細胞，或外周血淋巴細胞）取出體外，在一定條件下與抗原共同培養，然後再與骨髓瘤細胞進行融合。其基本方法是取4-8周齡BALB/c小鼠的脾臟，製成單細胞懸液，用無血清培養液洗滌2-3次，然後懸浮於含10%小牛血清的培養液中，再加入適量抗原（可溶性抗原0.5-5ug/ml，細胞抗原105-106個細胞/ml）和一定量的BALB/c小鼠胸腺細胞培養上清液；在37℃，6%CO2濃度下培養3-5天，再分離脾細胞與骨髓瘤細胞融合。

2、細胞融合

（1） 主要試劑的配製

a、 細胞培養基雜交瘤技術中使用的細胞培養基主要有RPMI-1640或DMEM（Dulberco Modified Eagles Medium）兩種基礎培養基，具體配製方法按廠家規定的程序，配好後過濾除菌（0.22um），分裝，4℃保存。

"不完全RPMI-1640培養基：RPMI-1640培養基原液96ml

100×L.G.溶液1ml

雙抗溶液1ml

7.5% NaHCO3溶液1-2ml

HEPES溶液1ml

"不完全DMEM培養基：DMEM 13.37g

超純水或四蒸水980ml

NaHCO3 3.7g

雙抗溶液10ml

100×L.G.溶液10ml

用1N HCl調試PH至7.2-7.4，過濾除菌，分裝4℃保存。

"完全RPMI-1640或DMEM培養基：不完全RPMI-1640或DMEM培養基80ml

小牛血清15-20ml

用於骨髓瘤細胞SP2/0和建株後的雜交瘤細胞培養。

"HT培養基：完全RPMI-1640或DMEM培養基99ml

HT貯存液1ml

"HAT培養基：完全RPMI-1640或DMEM培養基98ml

HT貯存液1ml

A貯存液1ml

b、 氨基喋呤（A）貯存液（100×，4×10-5mol/L） : 稱取1.76mg氨基喋呤（Aminopterin MW 440.4），溶於90ml超純水或四蒸水中，滴加1mol/L NaOH 0.5ml中和，再補加超純水或四蒸水至100ml。過濾除菌，分裝小瓶（2ml/瓶），-20℃保存。

c、次黃嘌呤和胸腺嘧啶核苷（HT）貯存液(100×,H:10-2mol/L，T：1.6×10-3mol/L): 稱取136.1mg次黃嘌呤(Hypoxanthine,MW 136.1)和38.8mg胸腺嘧啶核苷(Thymidine,MW 242.2)，加超純水或四蒸水至100ml，置45-50℃水浴中使完全溶解，過濾除菌，分裝小瓶（2ml/瓶），-20℃凍存。用前可置37℃加溫助溶。

d、 L-谷氨醯胺（L.G.）溶液（100×，0.2mol/L） : 稱取2.92g L-谷氨醯胺（L-glutamine，MW 146.15），用100ml不完全培養液或超純水（或四蒸水）溶解，過濾除菌，分裝小瓶（4-5ml/瓶），-20℃凍存。

e、 青、鏈黴素（雙抗）溶液（100×）: 取青黴素G（鈉鹽）100萬單位和鏈黴素（硫酸鹽）1g，溶於100ml滅菌超純水或四蒸水中，分裝小瓶（4-5ml/瓶），-20℃凍存。

f、 7.5% NaHCO3溶液 : 稱取分析純NaHCO3 7.5g，溶於100ml超純水或四蒸水中，過濾除菌，分裝小瓶（4-5ml/瓶），蓋緊瓶塞，4℃保存。

g、 HEPES溶液（1mol/L）: 稱取23.83g HEPES（N-2-Hydroxyethylpiperazine-N，-2-ethanesulfonic acid，N-2-羥乙基哌嗪- N，-2-乙基磺酸，MW 238.3）溶於100ml超純水或四蒸水中，過濾除菌，分裝小瓶（4-5ml/瓶），4℃保存。

h、 8-氮鳥嘌呤貯存液（100×）: 稱取200mg 8-氮鳥嘌呤（8-azaguanine，MW 152.1），加入4mol/L NaOH 1ml，待其溶解後，加入超純水或四蒸水99ml，過濾除菌；分裝小瓶，-20℃凍存。使用時按1%濃度加入到培養液中（即終濃度為20ug/ml）。

g. 用新配製的10% Giemsa染液染色10-20分鍾，然後用自來水洗去染液，自然乾燥。（Giemsa染液配方：Giemsa粉0.5g，甘油33ml，55-60℃保溫2小時，加甲醇33ml混勻，保存於棕色瓶內作為原液；取原液1份，加1/15mol/L PH6.8 PBS 9份，即成10% Giemsa染液）。

h. 鏡檢：選擇染色體分散好，無重疊，無失散的細胞進行觀察分析。每份標本應計數100個完整的中期核細胞，並注意觀察是否有標志染色體。

i、 50% PEG: 稱取PEG 1000 或4000 20-50g於三角瓶中，蓋緊，60-80℃水浴融化，0.6ml分裝於青黴素小瓶中，蓋緊，8磅高壓蒸汽15分鍾，-20℃存放備用。臨用前加熱融化，加等量不完全培養基，用少許7.5% NaHCO3調PH至8.0，或購買Sigma或Gibco公司現成產品。

⑵ 髓瘤細胞的准備
融合前骨髓瘤細胞維持的方式，對成功地得到雜交瘤是最為重要的。目標是使細胞處於對數生長的時間盡可能長，融合前肯定不能少於1周。凍存的細胞在復甦後要2周時間才能處於適合於融合的狀態，長過了的骨髓瘤細胞至少幾天才可能恢復。在實驗室中處於對數生長的骨髓瘤細胞維持在含10%小牛血清的培養基中，方法是用6個裝5ml培養基的培養瓶，接種10倍系列稀釋的骨髓瘤細胞。1周後到細胞相當密而又未長過的一瓶重新移植。典型的倍增時間為14-16小時。
骨髓瘤細胞懸液的制備方法如下：
a、於融合前48-36小時，將骨髓細胞擴大培養（一般按一塊96孔板的融合試驗約需2-3瓶100ml培養瓶培養的細胞進行准備）。
b、融合當天，用彎頭滴管將細胞從瓶壁瘤輕輕吹下，收集於50ml離心管或融合管內。
c、 1000r/min離心5-10分鍾，棄去上清。
d、加入30ml不完全培養基，同法離心洗滌一次。然後將細胞重懸浮於10ml不完全培養基，混勻。
e、取骨髓瘤細胞懸液，加0.4%台盼藍染液作活細胞計數後備用。細胞計數時，取細胞懸液0.1ml加入0.9ml台盼藍染液中，混勻，用血球計數板計數。計算細胞數目的公式為：每毫升細胞數=4個大方格細胞數×105/4；或每毫升細胞數=5個中方格細胞數×106/2

⑶ 脾淋巴細胞的准備
取已經免疫的BALB/c小鼠，摘除眼球采血，並分離血清作為抗體檢測時的陽性對照血清。同時通過頸脫位致死小鼠，浸泡於75%酒精中5分鍾，於解剖台板上固定後掀開左側腹部皮膚，可看到脾臟，換眼科剪鑷，在超凈台中用無菌手術剪剪開腹膜，取出脾臟置於已盛有10ml不完全培養基的平皿中，輕輕洗滌，並細心剝去周圍結締組織。將脾臟移入另一盛有10ml不完全培養基的平皿中，用彎頭鑷子或裝在1ml注射器上的彎針頭輕輕擠壓脾臟（也可用注射器內芯擠壓脾臟），使脾細胞進入平皿中的不完全培養基。用吸管吹打數次，製成單細胞懸液。為了除去脾細胞懸液中的大團塊，可用200目銅網過濾。收獲脾細胞懸液，1000r/min離心5-10分鍾，用不完全培養基離心洗滌1-2次，然後將細胞重懸於10ml不完全培養基混勻，取上述懸液，加台酚藍染液作活細胞計數後備用。通常每隻小鼠可得1×108-2.5×108個脾細胞，每隻大鼠脾臟可得5×108-10×108脾細胞。

⑷ 飼養細胞（Feeder cells）的制備
在細胞融合後選擇性培養過程中，由於大量骨髓瘤細胞和脾細胞相繼死亡，此時單個或少數分散的雜交瘤細胞多半不易存活，通常必須加入其他活細胞使之繁殖，這種被加入的活細胞稱為飼養細胞。飼養細胞促進其他細胞增殖的機制尚不明了，一般認為它們可能釋放非種屬特異性的生長刺激因子，為雜交瘤細胞提供必要的生長條件；也可能是為了滿足新生雜交瘤細胞對細胞密度的依賴性。
常用的飼養細胞有胸腺細胞、正常脾細胞和腹腔巨噬細胞。其中以小鼠腹腔巨噬細胞的來源及制備較為方便，且有吞噬清除死亡細胞及其碎片的作用，因此使用最為普遍。其制備方法如下：
按上述采小鼠脾細胞的方法將小鼠致死、體表消毒和固定後，用消毒剪鑷從後腹掀起腹部皮膚，暴露腹膜。用酒精棉球擦拭腹膜消毒。用注射器注射10ml不完全培養基至腹腔，注意避免穿入腸管。右手固定注射器，使針頭留置在腹腔內，左手持酒精棉球輕輕按摩腹部1分鍾，隨後吸出注入的培養液。1000r/min離心5-10分鍾，棄上清。先用5ml HAT培養基將沉澱細胞懸浮，根據細胞計數結果，補加HAT培養基，使細胞濃度為2×105/ml，備用。通常對巨噬細胞來說，96孔培養板每孔需2×104個細胞，24孔板每孔需105細胞。每隻小鼠可得3-5×106個細胞，因此一隻小鼠可供兩塊96孔板的飼養細胞。也可在細胞融合前1-2天制備並培養飼養細胞，這樣使培養板孔底先鋪上一層飼養細胞層。做法是，將上述細胞懸液加入96孔板，每孔0.1ml（相當於2滴），然後置37℃ 6% CO2的培養箱中培養。

⑸ 細胞融合與雜交瘤細胞的選擇性培養
細胞融合的程序已報道的有很多種，這里介紹的是作者所在實驗室常用的一種。
A、將1×108脾細胞與2×107-5×107骨髓瘤細胞SP2/0-Ag14混合於一支50ml融合管中，補加不完全培養基至30ml，充分混勻。
B、 1000r/min離心5-10分鍾，將上清盡量吸凈。
C、在手掌上輕擊融合管底，使沉澱細胞鬆散均勻;置40℃水浴中預熱。
D、用1ml吸管在1分鍾左右（最佳時間為45秒）加預熱至40℃的50% PEG（PH 8.0）1ml，邊加邊輕輕攪拌。
E、用10ml吸管在90秒內加20-30ml預熱至37℃的不完全培養基；20-37℃靜置10分鍾。
F、 1000r/min 5分鍾；棄去上清。
G、 加入5ml HAT培養基，輕輕吹吸沉澱細胞，使其懸浮並混勻，然後補加含腹腔巨噬細胞的HAT培養基至80-100ml。
H、分裝96孔細胞培養板，每孔0.10-0.15ml；分裝24孔板，每孔1.0-1.5ml；然後將培養板置37℃，6% CO2培養箱內培養。
I、 5天後用HAT培養基換出1/2培養基。
J、 7-10天後用HT培養基換出HAT培養基；（第14天後可用普通完全培養基）。
L、經常觀察雜交瘤細胞生長情況，待其長至孔底面積1/10以上時吸出上清供抗體檢測。

3、雜交瘤細胞篩選

雜交瘤細胞在融合後2周左右即可篩選，即把分泌所需抗體的雜交瘤孔從眾多的孔中選出來，通常也稱為抗體檢測。抗體檢測的方法很多，通常根據所研究的抗原和實驗室的條件而定。但作為雜交瘤篩選的抗體檢測方法必須具有快速、准備、簡便，便於一次處理大量樣品等特點。因為往往有幾百個樣品需要在短短幾個小時就報告結果，以便決定雜交瘤細胞的取捨。所以選用抗體檢測方法的原則是快速、敏感、特異、可靠、花費小和節省人力。一般說來，在融合之前就必須建立好抗體檢測方法，並克服可能存在的問題。另一個重要問題是抗體檢測方法所需要的「動力學范圍」，即檢出背景以上的最強與最弱信號之比，依所用的檢測抗原是否純凈而定。如雜交瘤抗體是針對純化的蛋白質抗原的，100%的抗原參與反應，一個陽性/陰性判別系統就夠了。另一方面，如果雜交瘤抗體是針對細胞表面微量的蛋白抗原，檢測系統可能需要能測出微弱信號，則動力學范圍至少應為10：1，最好為100：1。另外，檢測方法的選擇還受所需雜交瘤抗體的類型和預定的用途的影響。結合補體的抗體可以用基於細胞毒性反應的檢測方法來選出。如需結合A蛋白的雜交瘤抗體，就要用結合蛋白A的檢測方法。

下面簡要介紹幾種常用的抗體檢測方法：

⑴ 免疫酶技術

免疫酶技術是將抗原抗體反應的特異性和酶對底物顯色反應的高效催化作用有機結合而成的免疫學技術。由於它特異性強，靈敏度高，現已廣泛用於篩選和鑒定單抗。

A、器材和試劑

a. 包被緩沖液：

碳酸鹽緩沖液：取0.2mol/L Na2CO3 8ml，0.2mol/L NaHCO3 17ml混合，再加75ml蒸餾水，調PH至9.6。

Tris-HCl緩沖液（PH8.0，0.02mol/L）：取0.1mol/L Tris 100ml，0.1mol/L HCl 58.4ml混合，加蒸餾水至1000ml。

b. 洗滌緩沖液（PH7.2的PBS）：KH2PO4 0.2g，KCl 0.2g，Na2HPO4"12H2O 2.9g，NaCl 8.0g，Tween-20 0.5ml，加蒸餾水至1000ml。

c. 稀釋液和封閉液：牛血清白蛋白（BSA）0.1g，加洗滌液至100ml；或用洗滌液將小牛血清配成5-10%使用。

d. 酶反應終止液（2mol/L H2SO4）：取蒸餾水178.3ml，滴加濃硫酸（98%）21.7ml。

e. 底物緩沖液（PH5.0，磷酸鹽-檸檬酸緩沖液）：取0.2mol/L Na2HPO4 25.7ml，0.1ml/L檸檬酸24.3ml，再加50ml蒸餾水。檸檬酸溶液及配成的底物緩沖液不穩定，易形成沉澱，因此一次不宜配製過多。

f. 底物使用液：

OPD底物使用液（測490nm的OD值）：OPD 5mg，底物緩沖液10ml，3% H2O2 0.15ml。

TMBS或TMB底物使用液（測450nm的OD值）：TMBS或TMB（1mg/ml）1.0ml，底物緩沖液10ml，1% H2O2 25ul。

ABTS底物使用液（測410nm的OD值）：ABTS 0.5mg，底物緩沖液1ml，3% H2O2 2ul。

g. 抗體對照：以骨髓瘤細胞培養上清作為陰性對照，以免疫鼠血清作為陽性血清。

h. 抗原：可溶性抗原：盡量純化，以獲得高特異性。

病毒感染的傳代細胞或全菌抗原。

淋巴細胞等懸液。

i. 酶標抗鼠抗體或酶標SPA或其他類似試劑。

j. 細胞固定液：-20℃丙酮；或丙酮-甲醛固定液：Na2HPO4 100mg，KH2PO4 500mg，蒸餾水150ml，丙酮225ml，甲醛125ml；或丙酮-甲醛溶液（1;1）；或-20℃甲醇。

k. 聚苯乙烯微孔板：40孔、96孔、或條孔；硬板或軟板均可使用。

l. 酶聯免疫閱讀儀；或光鏡。

m. 吸管、加樣器及水浴箱、離心機等。

B、 可溶性抗原的酶聯免疫吸附試驗（ELISA）

a. 純化抗原用包被液稀釋至1-20ug/ml。

b. 以50-100ul/孔量加入酶標板孔中，置4℃過夜或37℃吸附2小時。

c. 棄去孔內的液體，同時用洗滌液洗3次，每次3-5分鍾，拍干。

d. 每孔加200ul封閉液4℃過夜或37℃封閉2小時；該步驟對於一些抗原，可省略。

e. 洗滌液洗3次；此時包被板可-20℃或4℃保存備用。

f. 每孔加50-100ul待檢雜交瘤細胞培養上清，同時設立陽性、陰性對照和空白對照；37℃孵育1-2小時；洗滌，拍干。

g. 加酶標第二抗體，每孔50-100ul，37℃孵育1-2小時，洗滌，拍干。

h. 加底物液，每孔加新鮮配製的底物使用液50-100ul，37℃10-30分鍾。

i. 以2mol/L H2SO4終止反應，在酶聯免疫閱讀儀上讀取OD值。

j. 結果判定：以P/N≥2.1，或P≥N 3D為陽性。若陰性對照孔無色或接近無色，陽性對照孔明確顯色，則可直接用肉眼觀察結果。

C、 全菌抗原的ELISAS

a. 新鮮培養的細菌用蒸餾水或PBS懸浮，並調整細菌濃度至1×108個/ml。必須指出，對於人畜共患病病原體需注意安全操作，最好是滅活處理。

b. 每孔中加100ul 5%戊二醛溶液（0.1mol/L NaHCO3 95ml 25%戊二醛溶液5ml），37℃作用2小時，蒸餾水洗滌3次；加上述細菌懸液50ul/孔；37-56℃烘乾；每孔加200ul封閉液4℃過夜或37℃ 2小時封閉。

c. 步驟b也可採用先每孔加50ul細菌懸液，37℃-56℃烘乾，然後用-20℃預冷的無水甲醇室溫作用15分鍾，蒸餾水洗滌3次；每孔加200ul封閉液4℃過夜或37℃ 2小時封閉。

d. 洗滌液洗3次；此時包被板可在-20℃或4℃保存備用。

e. 以下步驟同上法。

D、 用全細胞抗原的ELISA

a. 按常規方法培養細胞，接種病毒，收獲感染細胞和未感染細胞，進行細胞計數，用PBS製成適當濃度懸液。

b. 淋巴細胞懸液的制備採用新鮮外周血加肝素抗凝後，滴加於淋巴細胞分離液之上，1500rpm離心30分鍾，吸取界面細胞洗滌二次，即為新鮮淋巴細胞懸液。該細胞懸液中若仍混有紅細胞，離心後加0.83%的氯化銨溶液，室溫10分鍾，洗滌一次即可。將該細胞懸液稀釋至適當濃度。

c. 每孔加100ul上述a或b的細胞懸液，使每孔含細胞5×104個；1500r/min 15分鍾，甩去上清；室溫乾燥或吹乾後用丙酮-甲醇（1：1）4℃固定10分鍾；可4℃或-20℃保存備用。

d. 以下步驟同上法。

E、抗體捕捉ELISA試驗

本法用抗BALB/c小鼠Ig的多克隆抗體捕捉待檢樣品中的McAb，再依次加抗原、酶標多克隆抗體及底物顯色。該法是常用的ELISA中較理想的一種；其操作步驟如下：

a. 以適當濃度的純化抗鼠Ig抗體包被酶標板，每孔加100ul，37℃ 2小時或4℃過夜。

b. 洗滌、拍干後加待測的McAb樣品，37℃ 1-2小時。

c. 洗滌後加適量的抗原，37℃ 1-2小時。

d. 洗滌後加入酶標多克隆抗體，37℃ 1-2小時。洗滌後加底物顯色，判定結果。

3、骨髓瘤細胞培養液

培養基的成分過於復雜，都是買現成的粉末，然後會加雙蒸水配置，根據說明書添加其專他一些成分，過濾除屬菌，再加適當比例血清。
復甦時，先准備好37度水浴鍋。然後將凍存管從液氮中取出，用PE手套包好，迅速放入37度水浴鍋，不斷晃動，迅速解凍。在超凈台內將液體吸出移入ep管離心收集細胞，棄上清，用新鮮培養基重懸轉入細胞培養瓶，補加適量培養基。
注意事項：37度水浴要准確，解凍要迅速，注意無菌，離心轉速不要超過1200g等。
傳代時間要看起始密度，你可以根據細胞周期算，因為是腫瘤細胞，其生長周期不到24小時。

4、hbl-100細胞用什麼培養基

培養某一類型細胞沒有固定的培養條件。在MEM中培養的細胞，很可能在DMEM或M199中同樣很容易生長。總之，首選MEM做粘附細胞培養、RPMI-1640做懸浮細胞培養，各種目的無血清培養的首選是AIM V培養基（SFM）。在開始進行新的細胞培養時，可以參考下表所列的條件：
細胞系 細胞類型 種 組織 使用的培養基
293 成纖維細胞 人 胚胎腎 MEM, 10% 熱滅活馬血清
3T6 成纖維細胞 小鼠 胚胎 DMEM, 10% 胎牛血清
A549 上皮細胞 人 肺癌 F-12K, 10%胎牛血清
A9 成纖維細胞 小鼠 結締組織 DMEM, 10%胎牛血清
AtT-20 上皮細胞 小鼠 垂體腫瘤 F-10, 15% 馬血清和2.5% 胎牛血清
BALB/3T3 成纖維細胞 小鼠 胚胎 DMEM, 10% 胎牛血清
BHK-21 成纖維細胞 倉鼠 腎 GMEM, 10% 胎牛血清 或MEM, 10% 胎牛血清 和NEAA
BHL-100 上皮細胞 人 乳房 McCoy'5A, 10% 胎牛血清
BT 成纖維細胞 牛 鼻甲骨細胞 MEM, 10% 胎牛血清 和 NEAA
Caco-2 上皮細胞 人 結腸腺癌 MEM, 20% 胎牛血清 和NEAA
Chang 上皮細胞 人 肝臟 BME, 10% 小牛血清
CHO-K1 上皮細胞 倉鼠 F-12, 10% 胎牛血清
Clone 9 上皮細胞 大鼠 肝臟 F-12K, 10% 胎牛血清
Clone M-3 上皮細胞 小鼠 黑素瘤 F-10, 15% 馬血清和 2.5% 胎牛血清
COS-1 成纖維細胞 猴 腎 DMEM, 10% 胎牛血清
COS-3 成纖維細胞 猴 腎 DMEM, 10% 胎牛血清
COS-7 成纖維細胞 猴 腎 DMEM, 10% 胎牛血清
CRFK 上皮細胞 貓 腎 MEM, 10% 胎牛血清 和NEAA
CV-1 成纖維細胞 猴 腎 MEM, 10% 胎牛血清
D-17 上皮細胞 狗 骨肉瘤 MEM, 10% 胎牛血清 和NEAA
Daudi 成淋巴細胞 人 淋巴瘤病人血液 RPMI-1640, 10% 胎牛血清
GH1 上皮細胞 大鼠 垂體腫瘤 F-10, 15% 馬血清和 2.5% 胎牛血清
GH3 上皮細胞 大鼠 垂體腫瘤 F-10, 15% 馬血清和2.5% 胎牛血清
H9 成淋巴細胞 人 T細胞淋巴瘤 RPMI-1640, 20% 胎牛血清
HaK 上皮細胞 倉鼠 腎 BME, 10% 小牛血清
HCT-15 上皮細胞 人 結腸直腸腺癌 RPMI-1640, 10% 胎牛血清
HeLa 上皮細胞 人 子宮頸癌 MEM, 10% 胎牛血清 和NEAA (in suspension, S-MEM)
HEp-2 上皮細胞 人 喉 癌 MEM, 10% 胎牛血清
HL-60 成淋巴細胞 人 早幼粒細胞白血病 RPMI-1640, 20% 胎牛血清
HT-1080 上皮細胞 人 纖維肉瘤 MEM, 10% HI 胎牛血清 和NEAA
HT-29 上皮細胞 人 結腸腺癌 McCoy's 5A, 10% 胎牛血清
HUVEC 內皮細胞 人 臍帶 F-12K, 10% 胎牛血清 和 肝素鹽 100 ug/ ml
I-10 上皮細胞 小鼠 睾丸癌 F-10, 15% 馬血清和 2.5% 胎牛血清
IM-9 成淋巴細胞 人 骨髓瘤病人骨髓 RPMI-1640, 10% 胎牛血清
JEG-2 上皮細胞 人 絨毛膜癌 MEM, 10% 胎牛血清
Jensen 成纖維細胞 大鼠 肉瘤 McCoy's 5A, 5% 胎牛血清
Jurkat 成淋巴細胞 人 淋巴瘤 RPMI-1640, 10% 胎牛血清
K-562 成淋巴細胞 人 骨髓性的白血病 RPMI-1640, 10% 胎牛血清
KB 上皮細胞 人 口腔癌 MEM, 10% 胎牛血清 和NEAA
KG-1 骨髓白細胞 人 紅白血病病人骨髓 IMDM, 20% 胎牛血清
L2 上皮細胞 大鼠 肺 F-12K, 10%胎牛血清
L6 大鼠 骨骼肌成肌細胞 DMEM, 10% 胎牛血清
LLC-WRC 256 上皮細胞 大鼠 癌 Medium 199, 5% 馬血清
McCoy 成纖維細胞 小鼠 未知 MEM, 10% 胎牛血清
MCF7 上皮細胞 人 癌 MEM, 10% 胎牛血清 NEAA, 10ug/ml 胰島素
WEHI-3b 類巨噬細胞 小鼠 骨髓單核細胞白血病 DMEM, 10% 胎牛血清
WI-38 上皮細胞 人 胚胎肺 BME, 10% 胎牛血清
WISH 上皮細胞 人 羊膜 BME, 10% 胎牛血清
WS1 人 胚胎皮膚 MEM, 10% 胎牛血清 和NEAA
XC 上皮細胞 大鼠 肉瘤 MEM, 10% 胎牛血清 和NEAA
Y-1 上皮細胞 小鼠 腎上腺瘤 F-10, 15% 馬血清和 2.5% 胎牛血清

5、請問哪位老師知道多發性骨髓瘤細胞株RPMI8226都有那些特點？是否具有平常所說的那些特點？比如是

K

6、有關培養基的知識？！

培養基（Medium）是供微生物、植物和動物組織生長和維持用的人工配製的養料，一般都含有碳水化合物、含氮物質、無機鹽（包括微量元素）以及維生素和水等。有的培養基還含有抗菌素和色素，用於單種微生物培養和鑒定。
簡介
培養基（Medium）是供微生物、植物和動物組織生長和維持用的人工配製的養料，一般都含
培養基
有碳水化合物、含氮物質、無機鹽（包括微量元素）以及生長素和水等。有的培養基還含有抗菌素、色素、激素和血清。
培養基由於配製的原料不同，使用要求不同，而貯存保管方面也稍有不同。一般培養基在受熱、吸潮後，易被細菌污染或分解變質，因此一般培養基必須防潮、避光、陰涼處保存。對一些需嚴格滅菌的培養基（如組織培養基），較長時間的貯存，必須放在2~6℃的冰箱內。由於液體培養基不易長期保管，現在均改製成粉末。

化學分類
固體培養基
天然培養基
指一類利用動、植物或微生物體包括其提取物製成的培養基。如牛肉膏蛋白腖培養基、麥芽汁培養基等。
組合培養基
又稱為合成培養基或綜合培養基，是一類按微生物的營養要求精確設計後用多種高純化學試劑配製成的培養基。如葡萄糖銨鹽培養基、澱粉硝酸鹽培養基等。
半組合培養基
指一類主要以化學試劑配製，同時還加有某種或某些天然成分的培養基。例如，馬鈴薯蔗糖培養基。

物理分類
液體培養基
一類配製成的液體狀態的基質。
液體培養基
固體培養基
一類配製成的固體狀態的基質。根據性質又分為固化培養基、非可逆性固化培養基、天然固態培養基、濾膜。
半固體培養基　
指在液體培養基中加入少量的凝固劑而配製成的半固體狀態的培養基。
脫水培養基
又稱預制乾燥培養基，指含有除水分外的一切成分的商品培養基。

微生物分類
選擇性培養基：一類根據某微生物的特殊營養要求或其對某化學、物理因素的抗性而設計的培養基，具有使混合菌樣中的劣勢菌變成優勢菌的功能，廣泛用於菌種篩選等領域。
鑒別培養基：一類在成分中加有能與目的菌的無色代謝產物發生顯色反應的指示劑，從而達到只須用肉眼辨別顏色就能方便的從近似菌落中找出目的菌菌落的培養基。例如，伊紅美藍乳糖培養基（EMB）。

常見培養基
細菌培養基
牛肉膏瓊脂培養基
牛肉膏0.3g，蛋白腖1.0g，氯化鈉0.5g，瓊脂 1.5g，水 100ml
在燒杯內加水100毫升，放入牛肉膏、蛋白腖和氯化鈉，用蠟筆在燒杯外作上記號後，放在火上加熱。待燒杯內各組分溶解後，加入瓊脂，不斷攪拌以免粘底。等瓊脂完全溶解後補足失水，用10%鹽酸或10%的氫氧化鈉調整pH值到7.2～7.6,分裝在各個試管里，加棉花塞，用高壓蒸汽滅菌：1.05千克每平方厘米、121攝氏度維持15~30分鍾。
馬鈴薯培養基
取新鮮牛心（除去脂肪和血管）250克，用刀細細剁成肉末後，加入500毫升蒸餾水和5克蛋白腖。在
細菌培養基
燒杯上做好記號，煮沸，轉用文火燉2小時。過濾，濾出的肉末乾燥處理，濾液pH值調到7.5左右。每支試管內加入10毫升肉湯和少量碎末狀的干牛心，滅菌，備用。
根瘤菌培養基
葡萄糖10g磷酸氫二鉀0.5g 碳酸鈣3g 硫酸鎂0.2g 酵母粉0.4g 瓊脂20g 水1000ml 1%結晶紫溶液1ml
先把瓊脂加水煮沸溶解，然後分別加入其他組分，攪拌使溶解後，分裝，滅菌，備用。
放線菌培養基
澱粉硝酸鹽培養基（高氏一號培養基）
可溶性澱粉 2.0g 硝酸鉀0.1g 磷酸氫二鉀0.05g氯化鈉0.05g 硫酸鎂0.05g 硫酸亞鐵0.001g 瓊脂2g 水100ml
先把澱粉放在燒杯里，用5毫升水調成糊狀後，倒入95毫升水，攪勻後加入其他葯品，使它溶解。在燒杯外做好記號，加熱到煮沸時加入瓊脂，不停攪拌，待瓊脂完全溶解後，補足失水。調整pH值到7.2～7.4，分裝後滅菌，備用。
麵粉瓊脂培養基
麵粉60g瓊脂20g 水1000ml
把麵粉用水調成糊狀，加水到500ml，放在文火上煮30分鍾。另取500ml水，放入瓊脂，加熱煮沸到溶解後，把兩液調勻，補充水分，調整pH值到7.4，分裝，滅菌，備用。
微藻培養基
BG-11培養基
NaNO31.5g K2HPO4 ·3H2O 0.04g MgSO4·7H2O0.075g CaCl2 ·2H2O 0.036g Citric Acid （檸檬酸 ）0.006g Ferric ammonium citrate（檸檬酸鐵銨）0.006gEDTA (dinatrium-salt) 0.001g Na2CO3 0.02g A5 + Co solution * （A5溶液1000×）1mlDistilled Water （蒸餾水）919ml
SE培養基

NaNO3

0.25g

K2HPO4 . 3H2O

0.075g

MgSO4 . 7H2O

0.075g

CaCl2 . 2H2O

0.025g

KH2PO4

0.175g

NaCl

0.025

Soil extract

40ml

FeCl3·6H2O

0.005

Fe—EDTA

1ml

A5 solution 1000×

1ml

distilled water

958ml

Soil Extract(土壤提取液)配置方法
取花園土未施過肥0。5kg置於燒杯或三角瓶中，加入蒸餾水1000毫升，瓶口用透氣塞封口，在水浴中沸水加熱2小時，冷卻數小時，在無菌條件下過濾，取上清液，將滅菌蒸餾水加入上清液至總體積1000毫升。土壤提取液保存在4ºC備用。
Compositionof the A5 solution
Addto 100 ml of distilled water:

H3BO3

286 mg

MnCl2 . 4H2O

181 mg

ZnSO4 . 7H2O

22 mg

CuSO4 . 5 H2O

7.9 mg

(NH4）6Mo7O24 .4H2O

3.9 mg

EDTA-Fe的配置方法：
將EDTA和FeCl3·6H2O分別溶於水和HCl(0.1N),混勻即可。

Na2EDTA

1g

distilled water

50ml

FeCl3·6H2O

81 mg

HCl（0.1N）

50ml

Pr培養基
Preparation:to 997 mL of glass-distilled water, add 1.0 g proteose peptone, 15.0 g agar,and the following stock solutions:

working solution

g/1000 mL H2O

NaNO3

0.25

CaCl2. 2H2O

0.025

MgSO4. 7H2O

0.075

K2HPO4

0.075

KH2PO4

0.175

NaCl

0.025

A5 solution

1ml

EDTA-Fe

1ml

FeCl3 (0.05%)

1ml

A5溶液和EDTA-Fe溶液配製方法同上。
真菌培養基
薩市（Sabouraud』s）培養基
蛋白腖10g 瓊脂20g 麥芽糖 40g 水1000ml
先把蛋白腖、瓊脂加水後，加熱，不斷攪拌，待瓊脂溶解後，加入40g麥芽糖（或葡萄糖），攪拌，使它溶解，然後分裝，滅菌，備用。
本培養菌是培養許多種類真菌所常用的。
馬鈴薯糖瓊脂培養基
把馬鈴薯洗凈去皮，取200g切成小塊，加水1000ml，煮沸半小時後，補足水分。在濾液中加入10g瓊脂，煮沸溶解後加糖20g（用於培養黴菌的加入蔗糖，用於培養酵母菌的加入葡萄糖），補足水分，分裝，滅菌，備用。
把這培養基的pH值調到7.2～7.4，配方中的糖，如用葡萄糖還可用來培養放線菌和芽孢桿菌。
豆芽汁培養基
黃豆芽100g瓊脂15 g 葡萄糖20g 水1000ml
洗凈黃豆芽，加水煮沸30分鍾。用紗布過濾，濾液中加入瓊脂，加熱溶解後放入糖，攪拌使它溶解，補足水分到1000ml，分裝，滅菌，備用。
把這培養基的pH值調到7.2～7.4，可用來培養細菌和放線菌。
豌豆瓊脂培養基
豌豆80粒瓊脂 5g 水200ml
取80粒干豌豆加水，煮沸1小時，用紗布過濾後，在濾液中加入瓊脂，煮沸到溶解，分裝，滅菌，備用。
瓊脂
食用菌菌種培養基
馬鈴薯-蔗糖-瓊脂培養基
20%馬鈴薯煮汁 1000ml 蔗糖20g 瓊脂18g
把馬鈴薯洗凈去皮後，切成小塊。稱取馬鈴薯小塊200g，加水1000ml，煮沸20分鍾後，過濾。在濾汁中補足水分到1000ml，即成20%馬鈴薯煮汁。在馬鈴薯煮汁中加入瓊脂和蔗糖，煮沸，使它溶解後，補足水分，分裝，滅菌，備用。使用該培養基對pH值要求不嚴格，可以不測定。
綜合馬鈴薯培養基
20%馬鈴薯煮汁1000 ml 磷酸二氫鉀3g 硫酸鎂1.5g葡萄糖20g 維生素10mg 瓊脂18g
先配製20%馬鈴薯煮汁，方法同上。在煮汁中加入上述各種組分，加熱溶解後補足水分，調整pH值到6。分裝，滅菌，備用。 該培養基用於培養和保存靈芝、平菇、香菇等食用菌菌種。
煙草的培養基
在植物組織培養時，通過調節IAA和CTK的比值能影響愈傷組織分化出根或芽。CTK/IAA高時,愈傷組織分化芽
CTK/IAA低時，分化根；CTK/IAA比例適中維持愈傷組織不分化
愈傷組織誘導培養基制備
以MS培養基母液為基礎,向潔凈鋁鍋中順序加入大量元素20×母液100mL,微量元素100×母液20mL,鐵鹽100×母液20mL ,維生素100×母液20mL,肌醇200×母液10mL,甘氨酸200×母液10mL,配製得MS培養基後，再加入0.5mg·L-1的BA8mL,0.5mg·L-1的NAA8mL.然後加入實際配製培養基體積約2/3-3/4的蒸餾水，加入40g蔗糖後攪拌使其溶化,用0.5mol·L-1的NaOH和0.5 mol·L-1的HCl調整pH值至5.8-6.0.加入14g瓊脂，將鋁鍋置於電爐上,攪拌加熱使瓊脂完全溶化，然後用蒸餾水定容至終體積2L,繼續加熱幾分鍾使之混合均勻後分裝於三角瓶中。
煙草葉片愈傷組織誘導
煙草
取一無菌培養皿，用解剖刀切取1-2片無菌苗葉片置於無菌培養皿中,並用解剖刀將葉片切成2mm2左右的小片，然後將其接種於准備好的培養基上,每瓶接種5小片，一共接種6瓶。接種後的三角平置於24條件下黑暗培養1周,然後在同樣溫度下有光照和全黑暗下培養3周直至愈傷組織形成(兩種情況各置3瓶).觀察愈傷組織誘導結果，統計愈傷組織誘導率。
器官分化及植株再生培養
將誘導的愈傷組織按類型分別轉入分化培養基上,置於連續光照，溫度20-22 C條件下培養3周,統計愈傷組織再生植株情況.
愈傷組織誘導的總體情況
煙草愈傷組織誘導培養4周後,愈傷組織基本形成，即排除因生長時間不夠而未形成愈傷的情況。具體情況見表一中所示,6瓶培養物均有愈傷形成，且都未發生污染,但誘導率幾乎各不相同.其中， 在光照條件下培養的3瓶平均愈傷誘導率為60.0℅, 在黑暗條件下培養的3瓶平均愈傷誘導率為46.7%.由於實驗過程中，外植體即煙草葉片取得偏小,接種時可能已有部分外植體的大部分細胞脫水死亡，使整個實驗的愈傷組織誘導率偏低,愈傷塊偏小。
動物細胞培養基
RPMI1640培養基是一個全營養型培養基，廣泛應用於哺乳動物細胞和雜交瘤細胞的培養，如人骨髓瘤細胞、鼠雜交瘤細胞、人白細胞以及B細胞和T細胞。最初設計用於懸浮細胞培養和人白血病細胞的單層細胞培養。

特殊培養基
選擇性培養基
選擇性培養基是指根據某種微生物的特殊營養要求或其對某化學、物理因素的抗性而設計的培養基。其功能是使混合菌樣中的劣勢菌變成優勢菌，從而提高該菌的篩選效率。
酵母菌富集培養基
葡萄糖5%尿素0.1% 硫化銨0.1% 磷酸二氫鉀0.25% 磷酸氫二鈉0.05% 七水合硫酸鎂0.1% 七水合硫酸鐵0.01% 酵母膏0.05%孟加拉國紅0.003% pH4.5
Ashby無氮培養基
富集好氧自生固氮菌
甘露醇1%磷酸二氫鉀0.02% 七水合硫酸鎂0.02% 氯化鈉0.02% 二水合硫酸鈣0.01% 碳酸鈣0.5%

鑒別培養基
EMB培養基
　常用於鑒別E.coli
蛋白腖10g乳糖5g 蔗糖5g 磷酸氫二鉀2g 伊紅Y 0.4g 美藍0.065g蒸餾水1000g pH7.2
2216E培養基配方
分離海洋微生物的培養基配方
蛋白腖5g 酵母膏1g 磷酸高鐵 0.01g 瓊脂15~20g 陳海水 1000ml 煮沸氫氧化鈉（5%）的溶液調PH值7.6~7.8
伊紅美藍培養基
可用於檢測水中大腸桿菌的含量
首先按以下組成配製基礎培養基。
蛋白腖10gNaCl 5g
瓊脂15~20g
將上述物質溶解後，用蒸餾水定容至1000mL，調節pH為7.6.滅菌後，冷卻至60℃左右，再按下面的比例，在無菌操作條件下加入滅菌的乳糖溶液、伊紅水溶液以及美藍水溶液。搖勻後，立即倒平板。溶液中的乳糖在高溫下會破壞，因此一般使用壓力為70kPa、溫度為115℃的條件滅菌20min.
基礎培養基 100mL 20%乳糖溶液2mL
2%伊紅水溶液 2mL 0.5%美藍水溶液1mL

天然細胞培養基——血清
天然培養基是指來自動物體液或利用組織分離提取的一類培養基，如血漿、血清、淋巴液、雞胚浸出液等。組織培養技術建立早期，體外培養細胞都是利用天然培養基。但是由於天然培養基製作過程復雜、批間差異大，因此逐漸為合成培養基所替代。目前廣泛使用的天然培養基是血清，另外各種組織提取液、促進細胞貼壁的膠原類物質在培養某些特殊細胞也是必不可少。
血清種類
目前用於組織培養的血清主要是牛血清，培養某些特殊細胞也用人血清、馬血清等。選擇用牛血清培養細胞的原因：來源充足、制備技術成熟、經過長時間的應用考驗人們對其有比較深入的理解。牛血清對絕大多數哺乳動物細胞都是適合的，但並不排除在培養某種細胞時使用其他動物血清更合適。
牛血清是細胞培養中用量最大的天然培養基，含有豐富的細胞生長必須的營養成份，具有極為重要的功能。牛血清分為小牛血清、新牛血清、胎牛血清。胎牛血清應取自剖腹產的胎牛；新牛血清取自出生24小時之內的新生牛；小牛血清取自出生10－30天的小牛。顯然，胎牛血清是質量最高的，因為胎牛還未接觸外界，血清中所含的抗體、補體等對細胞有害的成分最少。
血清的主要成分
血清樣本
血清是由血漿去除纖維蛋白而形成的一種很復雜的混合物，其組成成份雖大部分已知，但還有一部分尚不清楚，且血清組成及含量常隨供血動物的性別、年齡、生理條件和營養條件不同而異。血清中含有各種血漿蛋白、多肽、脂肪、碳水化合物、生長因子、激素、無機物等，這些物質對促進細胞生長或抑制生長活性是達到生理平衡的。
血清主要作用
1．提供基本營養物質：氨基酸、維生素、無機物、脂類物質、核酸衍生物等，是細胞生長必須的物質。
2．提供激素和各種生長因子：胰島素、腎上腺皮質激素（氫化可的松、地塞米松）、類固醇激素（雌二醇、睾酮、孕酮）等。生長因子如成纖維細胞生長因子、表皮生長因子、血小板生長因子等。
3．提供結合蛋白：結合蛋白作用是攜帶重要地低分子量物質，如白蛋白攜帶維生素、脂肪、以及激素等，轉鐵蛋白攜帶鐵。結合蛋白在細胞代謝過程中起重要作用。
4．提供促接觸和伸展因子使細胞貼壁免受機械損傷。
5．對培養中的細胞起到某些保護作用：有一些細胞，如內皮細胞、骨髓樣細胞可以釋放蛋白酶，血清中含有抗蛋白酶成分，起到中和作用。這種作用是偶然發現的，現在則有目的的使用血清來終止胰蛋白酶的消化作用。因為胰蛋白酶已經被廣泛用於貼壁細胞的消化傳代。血清蛋白形成了血清的粘度，可以保護細胞免受機械損傷，特別是在懸浮培養攪拌時，粘度起到重要作用。血清還含有一些微量元素和離子，他們在代謝解毒中起重要作用，如SeO3,硒等。
血清培養基主要問題
1．血清的成份可能有幾百種之多，目前對其准確的成份、含量及其作用機制仍不清楚，尤其是對其中一些多肽類生長因子、激素和脂類等尚未充分認識，這給研究工作帶來許多困難。
2．血清都是批量生產，各批量之間差異很大，而且血清保存期至多一年，因此，要保證每批血清的相似性極為困難，從而使實驗的標准化和連續性受到限制。
3．對大多數細胞，在體內狀態，血清不是它們接觸的生理學液體，只是在損傷癒合以及血液凝固過程中才接觸血清，因此使用血清有可能改變某種細胞在體內的正常狀態，血清可能促進某些細胞的生長（成纖維細胞）同時抑制另一類細胞生長（表皮細胞）。
4．血清含一些對細胞產生毒性的物質，如多胺氧化酶，能與來自高度繁殖細胞的多胺反應（如精胺、亞精胺）形成有細胞毒性作用的聚精胺。補體、抗體、細菌毒素等都會影響細胞生長，甚至造成細胞死亡。
5．動物個體不同，血清產地、批號不同，每批質量差異甚大，其成分不能保持一致。
6．取材中可能帶入支原體、病毒，對細胞產生潛在影響，可能導致實驗失敗或實驗結果不可靠性。
7．大規模生產中，血清來源越來越困難，價格昂貴，是構成動物細胞培養對生產成本的主要部分之一。
血清的質量標准
血清質量高低取決於兩方面因素：一是取材對象，二是取材過程。用於取材的動物應健康無病並且在指定的出生天數之內，取材過程應嚴格按照操作規程執行，制備出的血清要經過嚴格的質量鑒定。WHO公布的《用動物細胞體外培養生產生物製品規程》中的要求：
1．牛血清必須來自有文件證明無牛海綿狀腦病的牛群或國家。並應具備適當的監測系統。
2．有些國家還要求牛血清來自未用過反芻動物蛋白飼料的牛群。
3．證明所用牛血清中不含對所生產疫苗病毒的抑制物。
4．血清要通過濾膜過濾除菌，保證無菌。
5．無細菌、黴菌、支原體和病毒的污染，有些國家要求無細菌噬菌體污染。
6．對細胞有良好的支持繁殖作用。
我國在對牛血清的質量2000年版《中國生物製品主要原輔料質控標准》中提出比較嚴格的標准要求。包括蛋白質含量，細菌、真菌、支原體、牛病毒、大腸桿菌噬菌體、細菌內毒素，支持細胞增殖檢查。

外周血培養基配製
一、配製用水
培養基的大部分是水，所以水的質量直接影響培養基的質量。按Waymouth標准，水的電阻應為200萬奧姆，一般實驗室里以玻璃蒸餾器制備的
雙蒸水或三蒸水可以符合使用條件。
二、培養基
培養基有天然、人工兩種。一般實驗室使用的是RPMI-1640粉末培養基，以雙蒸或三蒸水配製。NaHCO3（或HCl）調pH至7.2～7.4，若pH值超
過7.6或遠低於6.8，則大多數細胞不能生長。RPMI-1640不耐高壓滅菌，使用前需經滅菌0.22μm孔徑濾膜濾過處理。
三、血清
培養中常使用小牛血清（或胎牛血清）。血清亦不能高壓滅菌，無菌的小牛血清需在56℃水浴30分鍾滅活補體，置4℃冰箱存放待用。配製時含
量視培養細胞種類、時間而定，一般用10—15%。由於血清成分復雜、條件不易控制，可選用無血清培養基。
四、抗菌素
為防止培養時期細菌的污染，可在培養基中添加適當抗菌素，一般用量與組織細胞培養相同：卡那黴素100單位/毫升，或雙抗--青黴素100單位/
毫升，鏈黴素100微克/毫升。
五、植物血凝素（PHA）
非增殖期的細胞不能制備染色體，如人外周血淋巴細胞，但在離體培養過程中，在PHA的作用下，可被刺激轉化為淋巴母細胞而進入有絲分裂。
經實驗測定其分裂高峰分別於培養後44—48小時和68—72小時。
PHA有粘多糖，蛋白質兩種重要成分。粘多糖促使有絲分裂，蛋白質起凝集作用。PHA激活的細胞數隨其濃度而增加，直至全部免疫活性細胞均
被激活為止，但PHA濃度過高會引起凝集，一般採用4%濃度為好。

7、知道人骨髓瘤細胞U266具體培養的信息嗎

U266細胞；人骨髓瘤細胞以培養瓶包裝，容積為75毫升，細胞數量達10的6次方，用專用防壓泡沫盒包裝，內層無菌自封袋，外層防壓保溫氣泡袋。使用者在接收、處理、保存、丟棄、轉讓及使用細胞的時候要遵守國內外有關的法律法規。

1) 細胞抗體熒光免疫方法驗證:
每管含有細胞數>1x106 cells/ml，經測試不含有HIV-1、HBV、HCV、支原體、細菌、酵母和真菌。密度超過90%，品牌認證，我們現貨供應細胞株、細胞系多達4000多種產品，您可放心采購。
2) 用大量次培養基做培養:
來自sciencell、ICLC、ATCC等細胞庫，從胚胎提取，於原代（或二代）凍存在液氮中，一律版採用乾冰運輸。客戶收到細胞後，從乾冰中取出放入液氮中保存，待實驗安排好後，解凍後即可以進行復甦培養。
U266細胞；人骨髓瘤細胞採用乾冰保存運輸。收到細胞時，若乾冰已經完全融化，請立即將細胞復甦培養；若尚留有乾冰，請立即將細胞放入液氮中保存待用，請按指定條件貯存細胞，切不可將細胞置於高溫環境。權

8、培養基的常見培養基

牛肉膏瓊脂培養基
牛肉膏0.3g ，蛋白腖1.0g，氯化鈉0.5g，瓊脂1.5g，水100ml
在燒杯內加水100ml，放入牛肉膏、蛋白腖和氯化鈉，用蠟筆在燒杯外作上記號後，放在火上加熱。待燒杯內各組分溶解後，加入瓊脂，不斷攪拌以免粘底。等瓊脂完全溶解後補足失水，用10%鹽酸或10%的氫氧化鈉調整pH值到7.2-7.6，分裝在各個試管里，加棉花塞，用高壓蒸汽滅菌：1.05千克每平方厘米、121攝氏度維持15-30分鍾。
牛心培養基
取新鮮牛心（除去脂肪和血管）250克，用刀細細剁成肉末後，加入500毫升蒸餾水和5克蛋白腖。在燒杯上做好記號，煮沸，轉用文火燉2小時。過濾，濾出的肉末乾燥處理，濾液pH值調到7.5左右。每支試管內加入10毫升肉湯和少量碎末狀的干牛心，滅菌，備用。
根瘤菌培養基
葡萄糖10g，磷酸氫二鉀0.5g，碳酸鈣3g，硫酸鎂0.2g，酵母粉0.4瓊脂20g，水1000ml，1%結晶紫溶液1ml。
先把瓊脂加水煮沸溶解，然後分別加入其他組分，攪拌使溶解後，分裝，滅菌，備用。 澱粉硝酸鹽培養基（高氏一號培養基）
可溶性澱粉2.0g，硝酸鉀0.1g，磷酸氫二鉀0.05g，氯化鈉0.05g，硫酸鎂0.05g，硫酸亞鐵0.001g，瓊脂2g，水100ml。
先把澱粉放在燒杯里，用5ml水調成糊狀後，倒入95ml水，攪勻後加入其他葯品，使它溶解。在燒杯外做好記號，加熱到煮沸時加入瓊脂，不停攪拌，待瓊脂完全溶解後，補足失水。調整pH值到7.2-7.4，分裝後滅菌，備用。
麵粉瓊脂培養基
麵粉60g，瓊脂20g，水1000ml
把麵粉用水調成糊狀，加水到500ml，放在文火上煮30分鍾。另取500ml水，放入瓊脂，加熱煮沸到溶解後，把兩液調勻，補充水分，調整pH值到7.4，分裝，滅菌，備用。 BG-11培養基
NaNO3 1.5g，K2HPO4 ·3H2O0.04g，MgSO4·7H2O0.075g，CaCl2 ·2H2O0.036g Citric Acid （檸檬酸 ）0.006g，Ferric ammonium citrate（檸檬酸鐵銨0.006g，EDTA (dinatrium-salt) 0.001g，Na2CO3 0.02g，A5 + Co solution * （A5溶液1000×）1ml Distilled Water （蒸餾水）919ml
SE培養基 NaNO3 0.25g K2HPO4 . 3H2O 0.075g MgSO4 . 7H2O 0.075g CaCl2 . 2H2O 0.025g KH2PO4 0.175g NaCl 0.025 Soil extract 40ml FeCl3·6H2O 0.005 Fe—EDTA 1ml A5 solution 1000× 1ml distilled water 958ml Soil Extract(土壤提取液)配置方法
取花園土未施過肥0.5kg置於燒杯或三角瓶中，加入蒸餾水1000毫升，瓶口用透氣塞封口，在水浴中沸水加熱2小時，冷卻數小時，在無菌條件下過濾，取上清液，將滅菌蒸餾水加入上清液至總體積1000毫升。土壤提取液保存在4ºC備用。
Composition of the A5 solution
Add to 100 ml of distilled water:（加入100ml 的蒸餾水） H3BO3 286 mg MnCl2 . 4H2O 181 mg ZnSO4 . 7H2O 22 mg CuSO4 . 5 H2O 7.9 mg (NH4）6Mo7O24 .4H2O 3.9 mg EDTA-Fe的配置方法：
將EDTA和FeCl3·6H2O分別溶於水和HCl(0.1N)，混勻即可。 Na2EDTA 1g distilled water 50ml FeCl3·6H2O 81 mg HCl（0.1N） 50ml Pr培養基
Preparation: to 997 mL of glass-distilled water, add 1.0 g proteose peptone, 15.0 g agar, and the following stock solutions: working solution g/1000 mL H2O NaNO3 0.25 CaCl2. 2H2O 0.025 MgSO4. 7H2O 0.075 K2HPO4 0.075 KH2PO4 0.175 NaCl 0.025 A5 solution 1ml EDTA-Fe 1ml FeCl3 (0.05%) 1ml A5溶液和EDTA-Fe溶液配製方法同上。 薩市（Sabouraud』s）培養基
蛋白腖10g，瓊脂20g，麥芽糖40g，水1000ml
先把蛋白腖、瓊脂加水後，加熱，不斷攪拌，待瓊脂溶解後，加入40g麥芽糖（或葡萄糖），攪拌，使它溶解，然後分裝，滅菌，備用。
本培養菌是培養許多種類真菌所常用的。
馬鈴薯糖瓊脂培養基
把馬鈴薯洗凈去皮，取200g切成小塊，加水1000ml，煮沸半小時後，補足水分。在濾液中加入10g瓊脂，煮沸溶解後加糖20g（用於培養黴菌的加入蔗糖，用於培養酵母菌的加入葡萄糖），補足水分，分裝，滅菌，備用。
把這培養基的pH值調到7.2-7.4，配方中的糖，如用葡萄糖還可用來培養放線菌和芽孢桿菌。
豆芽汁培養基
黃豆芽100g，瓊脂15g，葡萄糖20g，水1000ml
洗凈黃豆芽，加水煮沸30分鍾。用紗布過濾，濾液中加入瓊脂，加熱溶解後放入糖，攪拌使它溶解，補足水分到1000ml，分裝，滅菌，備用。
把這培養基的pH值調到7.2-7.4，可用來培養細菌和放線菌。
豌豆瓊脂培養基
豌豆80粒，瓊脂5g，水200ml
取80粒干豌豆加水，煮沸1小時，用紗布過濾後，在濾液中加入瓊脂，煮沸到溶解，分裝，滅菌，備用。 馬鈴薯-蔗糖-瓊脂培養基
20%馬鈴薯煮汁1000ml，蔗糖20g，瓊脂18g
把馬鈴薯洗凈去皮後，切成小塊。稱取馬鈴薯小塊200g，加水1000ml，煮沸20分鍾後，過濾。在濾汁中補足水分到1000ml，即成20%馬鈴薯煮汁。在馬鈴薯煮汁中加入瓊脂和蔗糖，煮沸，使它溶解後，補足水分，分裝，滅菌，備用。使用該培養基對pH值要求不嚴格，可以不測定。
綜合馬鈴薯培養基
20%馬鈴薯煮汁1000ml，磷酸二氫鉀3g，硫酸鎂1.5g，葡萄糖20g，維生素10mg，瓊脂18g
先配製20%馬鈴薯煮汁，方法同上。在煮汁中加入上述各種組分，加熱溶解後補足水分，調整pH值到6。分裝，滅菌，備用。 該培養基用於培養和保存靈芝、平菇、香菇等食用菌菌種。 在植物組織培養時，通過調節IAA和CTK的比值能影響愈傷組織分化出根或芽。CTK/IAA高時，愈傷組織分化芽。
CTK/IAA低時，分化根；CTK/IAA比例適中維持愈傷組織不分化。
愈傷組織誘導培養基制備
以MS培養基母液為基礎，向潔凈鋁鍋中順序加入大量元素20×母液100mL,微量元素100×母液20mL,鐵鹽100×母液20mL ，維生素100×母液20mL，肌醇200×母液10mL,甘氨酸200×母液10mL，配製得MS培養基後，再加入0.5mg·L-1的BA8mL，0.5mg·L-1的NAA8mL。然後加入實際配製培養基體積約2/3-3/4的蒸餾水，加入40g蔗糖後攪拌使其溶化，用0.5mol·L-1的NaOH和0.5 mol·L-1的HCl調整pH值至5.8-6.0。加入14g瓊脂，將鋁鍋置於電爐上,攪拌加熱使瓊脂完全溶化，然後用蒸餾水定容至終體積2L，繼續加熱幾分鍾使之混合均勻後分裝於三角瓶中。
煙草葉片愈傷組織誘導取一無菌培養皿，用解剖刀切取1-2片無菌苗葉片置於無菌培養皿中，並用解剖刀將葉片切成2mm2左右的小片，然後將其接種於准備好的培養基上，每瓶接種5小片，一共接種6瓶。接種後的三角平置於24條件下黑暗培養1周，然後在同樣溫度下有光照和全黑暗下培養3周直至愈傷組織形成(兩種情況各置3瓶)。觀察愈傷組織誘導結果，統計愈傷組織誘導率。
器官分化及植株再生培養
將誘導的愈傷組織按類型分別轉入分化培養基上,置於連續光照，溫度20-22℃條件下培養3周，統計愈傷組織再生植株情況。
愈傷組織誘導的總體情況
煙草愈傷組織誘導培養4周後，愈傷組織基本形成，即排除因生長時間不夠而未形成愈傷的情況。具體情況見表一中所示。6瓶培養物均有愈傷形成，且都未發生污染，但誘導率幾乎各不相同。其中， 在光照條件下培養的3瓶平均愈傷誘導率為60.0℅，在黑暗條件下培養的3瓶平均愈傷誘導率為46.7%。由於實驗過程中，外植體即煙草葉片取得偏小，接種時可能已有部分外植體的大部分細胞脫水死亡，使整個實驗的愈傷組織誘導率偏低,愈傷塊偏小。 RPMI1640培養基是一個全營養型培養基，廣泛應用於哺乳動物細胞和雜交瘤細胞的培養，如人骨髓瘤細胞、鼠雜交瘤細胞、人白細胞以及B細胞和T細胞。最初設計用於懸浮細胞培養和人白血病細胞的單層細胞培養。

9、培養腫瘤細胞用什麼培養基

腫瘤細胞最好培養了，M199，RPMI-1640，DMEM都可以。我常用的是1640.