1、如何利用雜交瘤技術制備單克隆抗體
以下是我之前專門寫的一個教案，希望對你有幫助。
2013-04-27 11:29
1、動物免疫
(1) 抗原制備
制備單克隆抗體的免疫抗原，從純度上說雖不要求很高，但高純度的抗原使得到所需單抗的機會增加，同時可以減輕篩選的工作量。因此，免疫抗原是越純越好，應根據所研究的抗原和實驗室的條件來決定。一般來說，抗原的來源有限，或性質不穩定，提純時易變性，或其免疫原性很強，或所需單抗是用於抗原不同組分的純化或分析等，免疫用的抗原只需初步提純甚至不提純，但抗原中混雜物很多，特別是如果這些混雜物的免疫原性較強時，則必須對抗原進行純化。檢測用抗原可以是與免疫抗原純度相同，也可是不同的純度，這主要決定於所用篩檢方法的種類及其特異性和敏感性。
(2) 免疫動物的選擇
根據所用的骨髓瘤細胞可選用小鼠和大鼠作為免疫動物。因為，所有的供雜交瘤技術用的小鼠骨髓瘤細胞系均來源於BALB/c小鼠，所有的大鼠骨髓瘤細胞都來源於LOU/c大鼠，所以一般的雜交瘤生產都是用這兩種純系動物作為免疫動物。但是，有時為了特殊目的而需進行種間雜交，則可免疫其他動物。種間雜交瘤一般分泌抗體的能力不穩定，因為染色體容易丟失。就小鼠而言，初次免疫時以8-12周齡為宜，雌性鼠較便於操作。
(3) 免疫程序的確定
免疫是單抗制備過程中的重要環節之一，其目的在於使B淋巴細胞在特異抗原刺激下分化、增殖，以利於細胞融合形成雜交細胞，並增加獲得分泌特異性抗體的雜交瘤的機會。因此在設計免疫程序時，應考慮到抗原的性質和純度、抗原量、免疫途徑、免疫次數與間隔時間、佐劑的應用及動物對該抗原的應答能力等。沒有一個免疫程序能適用於各種抗原。現用的免疫程序中多數是參照制備常規多克隆抗體的方法。表6-1列舉了目前常用的免疫程序。免疫途徑常用體內免疫法包括皮下注射、腹腔或靜脈注射，也採用足墊、皮內、滴鼻或點眼。最後一次加強免疫多採用腹腔或靜脈注射，目前尤其推崇後者，因為可使抗原對脾細胞作用更迅速而充分。在最後一次加強免疫後第3天取脾融合為好，許多實驗室的結果表明，初次免疫和再次免疫應答反應中，取脾細胞與骨髓瘤細胞融合，特異性雜交瘤的形成高峰分別為第4天和第22天，在初次免疫應答時獲得的雜交瘤主要分泌IgM抗體，再次免疫應答時獲得的雜交瘤主要分泌IgG抗體。筆者體會陽性雜交瘤出現的高峰與小鼠血清抗體的滴度並無明顯的平行關系，且多在血清抗體高峰之前。因此，為達到最高的雜交瘤形成率需要有盡可能多的漿母細胞，這在最後一次加強免疫後第3天取脾進行融合較適宜。已有人報道採用脾內免疫，可提高小鼠對抗原的免疫反應性，且節省時間，一般免疫3天後即可融合。
2、細胞融合
（1） 主要試劑的配製
a、 細胞培養基 雜交瘤技術中使用的細胞培養基主要有RPMI-1640或DMEM（Dulberco Modified Eagles Medium）兩種基礎培養基，具體配製方法按廠家規定的程序，配好後過濾除菌（0.22um），分裝，4℃保存。
不完全RPMI-1640培養基：RPMI-1640培養基原液96ml
100×L.G.溶液1ml
雙抗溶液1ml
7.5% NaHCO3溶液1-2ml
HEPES溶液1ml
不完全DMEM培養基：DMEM 13.37g
超純水或四蒸水980ml
NaHCO3 3.7g
雙抗溶液10ml
100×L.G.溶液10ml
用1N HCl調試PH至7.2-7.4，過濾除菌，分裝4℃保存。
完全RPMI-1640或DMEM培養基：不完全RPMI-1640或DMEM培養基80ml
小牛血清15-20ml
用於骨髓瘤細胞SP2/0和建株後的雜交瘤細胞培養。
HT培養基：完全RPMI-1640或DMEM培養基99ml
HT貯存液1ml
HAT培養基：完全RPMI-1640或DMEM培養基98ml
HT貯存液1ml
A貯存液1ml
b、 氨基喋呤（A）貯存液（100×，4×10-5mol/L） : 稱取1.76mg氨基喋呤（Aminopterin MW 440.4），溶於90ml超純水或四蒸水中，滴加1mol/L NaOH 0.5ml中和，再補加超純水或四蒸水至100ml。過濾除菌，分裝小瓶（2ml/瓶），-20℃保存。
c、 次黃嘌呤和胸腺嘧啶核苷（HT）貯存液(100×,H:10-2mol/L，T：1.6×10-3mol/L): 稱取136.1mg次黃嘌呤(Hypoxanthine,MW 136.1)和38.8mg胸腺嘧啶核苷(Thymidine,MW 242.2)，加超純水或四蒸水至100ml，置45-50℃水浴中使完全溶解，過濾除菌，分裝小瓶（2ml/瓶），-20℃凍存。用前可置37℃加溫助溶。
d、 L-谷氨醯胺（L.G.）溶液（100×，0.2mol/L） : 稱取2.92g L-谷氨醯胺（L-glutamine，MW 146.15），用100ml不完全培養液或超純水（或四蒸水）溶解，過濾除菌，分裝小瓶（4-5ml/瓶），-20℃凍存。
e、 青、鏈黴素（雙抗）溶液（100×）: 取青黴素G（鈉鹽）100萬單位和鏈黴素（硫酸鹽）1g，溶於100ml滅菌超純水或四蒸水中，分裝小瓶（4-5ml/瓶），-20℃凍存。
f、 7.5% NaHCO3溶液 : 稱取分析純NaHCO3 7.5g，溶於100ml超純水或四蒸水中，過濾除菌，分裝小瓶（4-5ml/瓶），蓋緊瓶塞，4℃保存。
g、 HEPES溶液（1 mol/L）: 稱取23.83g HEPES（N-2-Hydroxyethylpiperazine-N，-2-ethanesulfonic acid，N-2-羥乙基哌嗪- N，-2-乙基磺酸，MW 238.3）溶於100 ml超純水或四蒸水中，過濾除菌，分裝小瓶（4-5 ml/瓶），4℃保存。
h、 8-氮鳥嘌呤貯存液（100×）: 稱取200 mg 8-氮鳥嘌呤（8-azaguanine，MW 152.1），加入4 mol/L NaOH 1 ml，待其溶解後，加入超純水或四蒸水99 ml，過濾除菌；分裝小瓶，-20℃凍存。使用時按1%濃度加入到培養液中（即終濃度為20 ug/ml）。
i、 50% PEG: 稱取PEG 1 000 或4 000 20-50 g於三角瓶中，蓋緊，60-80℃水浴融化，0.6 ml分裝於青黴素小瓶中，蓋緊，8磅高壓蒸汽15分鍾，-20℃存放備用。臨用前加熱融化，加等量不完全培養基，用少許7.5% NaHCO3調pH至8.0，或購買Sigma或Gibco公司現成產品。
⑵ 髓瘤細胞的准備
融合前骨髓瘤細胞維持的方式，對成功地得到雜交瘤是最為重要的。目標是使細胞處於對數生長的時間盡可能長，融合前肯定不能少於1周。凍存的細胞在復甦後要2周時間才能處於適合於融合的狀態，長過了的骨髓瘤細胞至少幾天才可能恢復。在實驗室中處於對數生長的骨髓瘤細胞維持在含10%小牛血清的培養基中，方法是用6個裝5 ml培養基的培養瓶，接種10倍系列稀釋的骨髓瘤細胞。1周後到細胞相當密而又未長過的一瓶重新移植。典型的倍增時間為14-16小時。
骨髓瘤細胞懸液的制備方法如下：
a、 於融合前48-36小時，將骨髓細胞擴大培養（一般按一塊96孔板的融合試驗約需2-3瓶100 ml培養瓶培養的細胞進行准備）。
b、 融合當天，用彎頭滴管將細胞從瓶壁瘤輕輕吹下，收集於50 ml離心管或融合管內。
c、 1000 r/min離心5-10分鍾，棄去上清。
d、 加入30 ml不完全培養基，同法離心洗滌一次。然後將細胞重懸浮於10 ml不完全培養基，混勻。
e、 取骨髓瘤細胞懸液，加0.4%台盼藍染液作活細胞計數後備用。細胞計數時，取細胞懸液0.1 ml加入0.9 ml台盼藍染液中，混勻，用血球計數板計數。計算細胞數目的公式為：每毫升細胞數=4個大方格細胞數×105/4；或每毫升細胞數=5個中方格細胞數×106/2
⑶ 脾淋巴細胞的准備
取已經免疫的BALB/c小鼠，摘除眼球采血，並分離血清作為抗體檢測時的陽性對照血清。同時通過頸脫位致死小鼠，浸泡於75%酒精中5分鍾，於解剖台板上固定後掀開左側腹部皮膚，可看到脾臟，換眼科剪鑷，在超凈台中用無菌手術剪剪開腹膜，取出脾臟置於已盛有10ml不完全培養基的平皿中，輕輕洗滌，並細心剝去周圍結締組織。將脾臟移入另一盛有10ml不完全培養基的平皿中，用彎頭鑷子或裝在1ml注射器上的彎針頭輕輕擠壓脾臟（也可用注射器內芯擠壓脾臟），使脾細胞進入平皿中的不完全培養基。用吸管吹打數次，製成單細胞懸液。為了除去脾細胞懸液中的大團塊，可用200目銅網過濾。收獲脾細胞懸液，1000r/min離心5-10分鍾，用不完全培養基離心洗滌1-2次，然後將細胞重懸於10ml不完全培養基混勻，取上述懸液，加台酚藍染液作活細胞計數後備用。通常每隻小鼠可得1×108-2.5×108個脾細胞，每隻大鼠脾臟可得5×108-10×108脾細胞。
⑷ 飼養細胞（Feeder cells）的制備
在細胞融合後選擇性培養過程中，由於大量骨髓瘤細胞和脾細胞相繼死亡，此時單個或少數分散的雜交瘤細胞多半不易存活，通常必須加入其他活細胞使之繁殖，這種被加入的活細胞稱為飼養細胞。飼養細胞促進其他細胞增殖的機制尚不明了，一般認為它們可能釋放非種屬特異性的生長刺激因子，為雜交瘤細胞提供必要的生長條件；也可能是為了滿足新生雜交瘤細胞對細胞密度的依賴性。
常用的飼養細胞有胸腺細胞、正常脾細胞和腹腔巨噬細胞。其中以小鼠腹腔巨噬細胞的來源及制備較為方便，且有吞噬清除死亡細胞及其碎片的作用，因此使用最為普遍。其制備方法如下：
按上述采小鼠脾細胞的方法將小鼠致死、體表消毒和固定後，用消毒剪鑷從後腹掀起腹部皮膚，暴露腹膜。用酒精棉球擦拭腹膜消毒。用注射器注射10ml不完全培養基至腹腔，注意避免穿入腸管。右手固定注射器，使針頭留置在腹腔內，左手持酒精棉球輕輕按摩腹部1分鍾，隨後吸出注入的培養液。1000r/min離心5-10分鍾，棄上清。先用5ml HAT培養基將沉澱細胞懸浮，根據細胞計數結果，補加HAT培養基，使細胞濃度為2×105/ml，備用。通常對巨噬細胞來說，96孔培養板每孔需2×104個細胞，24孔板每孔需105細胞。每隻小鼠可得3-5×106個細胞，因此一隻小鼠可供兩塊96孔板的飼養細胞。也可在細胞融合前1-2天制備並培養飼養細胞，這樣使培養板孔底先鋪上一層飼養細胞層。做法是，將上述細胞懸液加入96孔板，每孔0.1ml（相當於2滴），然後置37℃ 6% CO2的培養箱中培養。
⑸ 細胞融合與雜交瘤細胞的選擇性培養
細胞融合的程序已報道的有很多種，這里介紹的是作者所在實驗室常用的一種。
A、 將1×108脾細胞與2×107-5×107骨髓瘤細胞SP2/0-Ag14混合於一支50ml融合管中，補加不完全培養基至30ml，充分混勻。
B、 1000r/min離心5-10分鍾，將上清盡量吸凈。
C、 在手掌上輕擊融合管底，使沉澱細胞鬆散均勻;置40℃水浴中預熱。
D、 用1ml吸管在1分鍾左右（最佳時間為45秒）加預熱至40℃的50% PEG（PH 8.0）1ml，邊加邊輕輕攪拌。
E、 用10ml吸管在90秒內加20-30ml預熱至37℃的不完全培養基；20-37℃靜置10分鍾。
F、 1000r/min 5分鍾；棄去上清。
G、 加入5ml HAT培養基，輕輕吹吸沉澱細胞，使其懸浮並混勻，然後補加含腹腔巨噬細胞的HAT培養基至80-100ml。
H、 分裝96孔細胞培養板，每孔0.10-0.15ml；分裝24孔板，每孔1.0-1.5ml；然後將培養板置37℃，6% CO2培養箱內培養。
I、 5天後用HAT培養基換出1/2培養基。
J、 7-10天後用HT培養基換出HAT培養基；（第14天後可用普通完全培養基）。
L、 經常觀察雜交瘤細胞生長情況，待其長至孔底面積1/10以上時吸出上清供抗體檢測。
3、雜交瘤細胞篩選
雜交瘤細胞在融合後2周左右即可篩選，即把分泌所需抗體的雜交瘤孔從眾多的孔中選出來，通常也稱為抗體檢測。抗體檢測的方法很多，通常根據所研究的抗原和實驗室的條件而定。但作為雜交瘤篩選的抗體檢測方法必須具有快速、准備、簡便，便於一次處理大量樣品等特點。因為往往有幾百個樣品需要在短短幾個小時就報告結果，以便決定雜交瘤細胞的取捨。所以選用抗體檢測方法的原則是快速、敏感、特異、可靠、花費小和節省人力。一般說來，在融合之前就必須建立好抗體檢測方法，並克服可能存在的問題。另一個重要問題是抗體檢測方法所需要的「動力學范圍」，即檢出背景以上的最強與最弱信號之比，依所用的檢測抗原是否純凈而定。如雜交瘤抗體是針對純化的蛋白質抗原的，100%的抗原參與反應，一個陽性/陰性判別系統就夠了。另一方面，如果雜交瘤抗體是針對細胞表面微量的蛋白抗原，檢測系統可能需要能測出微弱信號，則動力學范圍至少應為10：1，最好為100：1。另外，檢測方法的選擇還受所需雜交瘤抗體的類型和預定的用途的影響。結合補體的抗體可以用基於細胞毒性反應的檢測方法來選出。如需結合A蛋白的雜交瘤抗體，就要用結合蛋白A的檢測方法。
2、骨髓瘤 培養
雜交瘤技術在具體操作上，各實驗室使用的程序不盡一致。本節中介紹的方法是作者所在實驗室採用的、實踐證明成熟的程序，該程序適合國內大多數實驗室。
在開展雜交瘤技術制備單抗之前，培養骨髓瘤和雜交瘤細胞必須具備下列主要儀器設備：超凈工作台、CO2恆溫培養箱、超低溫冰箱（-70℃）、倒置顯微鏡、精密天平或電子天平、液氮罐、離心機（水平轉子，4000r/min）、37℃水浴箱、純水裝置、濾器、真空泵等。其需要的主要器械包括：100ml、50ml、25ml細胞培養瓶，10ml、1ml刻度吸管，試管，滴管（彎頭、直頭），平皿，燒杯，500ml、250ml、100ml鹽水瓶，青黴素小瓶，10ml、5ml、1ml注射器等，96孔、24孔細胞培養板，融合管（50ml圓底帶蓋玻璃或塑料離心管），眼科剪刀，眼科鑷，血細胞計數板，可調微量加樣器（~50ul，~200ul，~1000ul），彎頭針頭，200目篩網，小鼠固定裝置等。此外，雜交瘤細胞的篩選與檢測的儀器設備，依據檢測單抗的方法不同而各異，請參閱本節有關部分。
淋巴細胞雜交瘤技術的主要步驟包括：動物免疫、細胞融合、雜交瘤細胞的篩選與單抗檢測、雜交瘤細胞的克隆化、凍存、單抗的鑒定等，圖6-1概括了淋巴細胞雜交瘤技術研製單抗的主要過程。
1、動物免疫
(1) 抗原制備制備單克隆抗體的免疫抗原，從純度上說雖不要求很高，但高純度的抗原使得到所需單抗的機會增加，同時可以減輕篩選的工作量。因此，免疫抗原是越純越好，應根據所研究的抗原和實驗室的條件來決定。一般來說，抗原的來源有限，或性質不穩定，提純時易變性，或其免疫原性很強，或所需單抗是用於抗原不同組分的純化或分析等，免疫用的抗原只需初步提純甚至不提純，但抗原中混雜物很多，特別是如果這些混雜物的免疫原性較強時，則必須對抗原進行純化。檢測用抗原可以是與免疫抗原純度相同，也可是不同的純度，這主要決定於所用篩檢方法的種類及其特異性和敏感性。
(2) 免疫動物的選擇根據所用的骨髓瘤細胞可選用小鼠和大鼠作為免疫動物。因為，所有的供雜交瘤技術用的小鼠骨髓瘤細胞系均來源於BALB/c小鼠，所有的大鼠骨髓瘤細胞都來源於LOU/c大鼠，所以一般的雜交瘤生產都是用這兩種純系動物作為免疫動物。但是，有時為了特殊目的而需進行種間雜交，則可免疫其他動物。種間雜交瘤一般分泌抗體的能力不穩定，因為染色體容易丟失。就小鼠而言，初次免疫時以8-12周齡為宜，雌性鼠較便於操作。
(3) 免疫程序的確定免疫是單抗制備過程中的重要環節之一，其目的在於使B淋巴細胞在特異抗原刺激下分化、增殖，以利於細胞融合形成雜交細胞，並增加獲得分泌特異性抗體的雜交瘤的機會。因此在設計免疫程序時，應考慮到抗原的性質和純度、抗原量、免疫途徑、免疫次數與間隔時間、佐劑的應用及動物對該抗原的應答能力等。沒有一個免疫程序能適用於各種抗原。現用的免疫程序中多數是參照制備常規多克隆抗體的方法。表6-1列舉了目前常用的免疫程序。免疫途徑常用體內免疫法包括皮下注射、腹腔或靜脈注射，也採用足墊、皮內、滴鼻或點眼。最後一次加強免疫多採用腹腔或靜脈注射，目前尤其推崇後者，因為可使抗原對脾細胞作用更迅速而充分。在最後一次加強免疫後第3天取脾融合為好，許多實驗室的結果表明，初次免疫和再次免疫應答反應中，取脾細胞與骨髓瘤細胞
融合，特異性雜交瘤的形成高峰分別為第4天和第22天，在初次免疫應答時獲得的雜交瘤主要分泌IgM抗體，再次免疫應答時獲得的雜交瘤主要分泌IgG抗體。筆者體會陽性雜交瘤出現的高峰與小鼠血清抗體的滴度並無明顯的平行關系，且多在血清抗體高峰之前。因此，為達到最高的雜交瘤形成率需要有盡可能多的漿母細胞，這在最後一次加強免疫後第3天取脾進行融合較適宜。已有人報道採用脾內免疫，可提高小鼠對抗原的免疫反應性，且節省時間，一般免疫3天後即可融合。
表6-1 不同免疫抗原的免疫程序
免疫原特性 抗原量 接種次數 間隔時間 單抗的特性 抗體滴度 親和性
免疫原性強（如細胞、細菌和病毒等） 106-107個細胞或1-10ug 2-4 2-4周 高 中等至強
免疫原性中等 10-100ug 2-4 2-4周 中等或高中等或強
免疫原性弱 A.20-400ug 2-4 隨後 2-3 每月 2-3月中等 強
B.10-50ug 其後 200-400ug 2 其後 4 每月 每天 中等 中等
C.10-100ug 2 其後 4 其後「休息」 最後加強 每月 10天 1-2月
中等 中等或強
體內免疫法適用於免疫原性強、來源充分的抗原，對於免疫原性很弱或對機體有害（如引起免疫抑制）的抗原就不適用了。如果制備人單克隆抗體幾乎不大可能採用體內免疫法。因此，針對這些情況，可採用體外免疫。所謂體外免疫就是將脾細胞（或淋巴結細胞，或外周血淋巴細胞）取出體外，在一定條件下與抗原共同培養，然後再與骨髓瘤細胞進行融合。其基本方法是取4-8周齡BALB/c小鼠的脾臟，製成單細胞懸液，用無血清培養液洗滌2-3次，然後懸浮於含10%小牛血清的培養液中，再加入適量抗原（可溶性抗原0.5-5ug/ml，細胞抗原105-106個細胞/ml）和一定量的BALB/c小鼠胸腺細胞培養上清液；在37℃，6%CO2濃度下培養3-5天，再分離脾細胞與骨髓瘤細胞融合。
2、細胞融合
（1） 主要試劑的配製
a、 細胞培養基雜交瘤技術中使用的細胞培養基主要有RPMI-1640或DMEM（Dulberco Modified Eagles Medium）兩種基礎培養基，具體配製方法按廠家規定的程序，配好後過濾除菌（0.22um），分裝，4℃保存。
"不完全RPMI-1640培養基：RPMI-1640培養基原液96ml
100×L.G.溶液1ml
雙抗溶液1ml
7.5% NaHCO3溶液1-2ml
HEPES溶液1ml
"不完全DMEM培養基：DMEM 13.37g
超純水或四蒸水980ml
NaHCO3 3.7g
雙抗溶液10ml
100×L.G.溶液10ml
用1N HCl調試PH至7.2-7.4，過濾除菌，分裝4℃保存。
"完全RPMI-1640或DMEM培養基：不完全RPMI-1640或DMEM培養基80ml
小牛血清15-20ml
用於骨髓瘤細胞SP2/0和建株後的雜交瘤細胞培養。
"HT培養基：完全RPMI-1640或DMEM培養基99ml
HT貯存液1ml
"HAT培養基：完全RPMI-1640或DMEM培養基98ml
HT貯存液1ml
A貯存液1ml
b、 氨基喋呤（A）貯存液（100×，4×10-5mol/L） : 稱取1.76mg氨基喋呤（Aminopterin MW 440.4），溶於90ml超純水或四蒸水中，滴加1mol/L NaOH 0.5ml中和，再補加超純水或四蒸水至100ml。過濾除菌，分裝小瓶（2ml/瓶），-20℃保存。
c、次黃嘌呤和胸腺嘧啶核苷（HT）貯存液(100×,H:10-2mol/L，T：1.6×10-3mol/L): 稱取136.1mg次黃嘌呤(Hypoxanthine,MW 136.1)和38.8mg胸腺嘧啶核苷(Thymidine,MW 242.2)，加超純水或四蒸水至100ml，置45-50℃水浴中使完全溶解，過濾除菌，分裝小瓶（2ml/瓶），-20℃凍存。用前可置37℃加溫助溶。
d、 L-谷氨醯胺（L.G.）溶液（100×，0.2mol/L） : 稱取2.92g L-谷氨醯胺（L-glutamine，MW 146.15），用100ml不完全培養液或超純水（或四蒸水）溶解，過濾除菌，分裝小瓶（4-5ml/瓶），-20℃凍存。
e、 青、鏈黴素（雙抗）溶液（100×）: 取青黴素G（鈉鹽）100萬單位和鏈黴素（硫酸鹽）1g，溶於100ml滅菌超純水或四蒸水中，分裝小瓶（4-5ml/瓶），-20℃凍存。
f、 7.5% NaHCO3溶液 : 稱取分析純NaHCO3 7.5g，溶於100ml超純水或四蒸水中，過濾除菌，分裝小瓶（4-5ml/瓶），蓋緊瓶塞，4℃保存。
g、 HEPES溶液（1mol/L）: 稱取23.83g HEPES（N-2-Hydroxyethylpiperazine-N，-2-ethanesulfonic acid，N-2-羥乙基哌嗪- N，-2-乙基磺酸，MW 238.3）溶於100ml超純水或四蒸水中，過濾除菌，分裝小瓶（4-5ml/瓶），4℃保存。
h、 8-氮鳥嘌呤貯存液（100×）: 稱取200mg 8-氮鳥嘌呤（8-azaguanine，MW 152.1），加入4mol/L NaOH 1ml，待其溶解後，加入超純水或四蒸水99ml，過濾除菌；分裝小瓶，-20℃凍存。使用時按1%濃度加入到培養液中（即終濃度為20ug/ml）。
g. 用新配製的10% Giemsa染液染色10-20分鍾，然後用自來水洗去染液，自然乾燥。（Giemsa染液配方：Giemsa粉0.5g，甘油33ml，55-60℃保溫2小時，加甲醇33ml混勻，保存於棕色瓶內作為原液；取原液1份，加1/15mol/L PH6.8 PBS 9份，即成10% Giemsa染液）。
h. 鏡檢：選擇染色體分散好，無重疊，無失散的細胞進行觀察分析。每份標本應計數100個完整的中期核細胞，並注意觀察是否有標志染色體。
i、 50% PEG: 稱取PEG 1000 或4000 20-50g於三角瓶中，蓋緊，60-80℃水浴融化，0.6ml分裝於青黴素小瓶中，蓋緊，8磅高壓蒸汽15分鍾，-20℃存放備用。臨用前加熱融化，加等量不完全培養基，用少許7.5% NaHCO3調PH至8.0，或購買Sigma或Gibco公司現成產品。
⑵ 髓瘤細胞的准備
融合前骨髓瘤細胞維持的方式，對成功地得到雜交瘤是最為重要的。目標是使細胞處於對數生長的時間盡可能長，融合前肯定不能少於1周。凍存的細胞在復甦後要2周時間才能處於適合於融合的狀態，長過了的骨髓瘤細胞至少幾天才可能恢復。在實驗室中處於對數生長的骨髓瘤細胞維持在含10%小牛血清的培養基中，方法是用6個裝5ml培養基的培養瓶，接種10倍系列稀釋的骨髓瘤細胞。1周後到細胞相當密而又未長過的一瓶重新移植。典型的倍增時間為14-16小時。
骨髓瘤細胞懸液的制備方法如下：
a、於融合前48-36小時，將骨髓細胞擴大培養（一般按一塊96孔板的融合試驗約需2-3瓶100ml培養瓶培養的細胞進行准備）。
b、融合當天，用彎頭滴管將細胞從瓶壁瘤輕輕吹下，收集於50ml離心管或融合管內。
c、 1000r/min離心5-10分鍾，棄去上清。
d、加入30ml不完全培養基，同法離心洗滌一次。然後將細胞重懸浮於10ml不完全培養基，混勻。
e、取骨髓瘤細胞懸液，加0.4%台盼藍染液作活細胞計數後備用。細胞計數時，取細胞懸液0.1ml加入0.9ml台盼藍染液中，混勻，用血球計數板計數。計算細胞數目的公式為：每毫升細胞數=4個大方格細胞數×105/4；或每毫升細胞數=5個中方格細胞數×106/2
⑶ 脾淋巴細胞的准備
取已經免疫的BALB/c小鼠，摘除眼球采血，並分離血清作為抗體檢測時的陽性對照血清。同時通過頸脫位致死小鼠，浸泡於75%酒精中5分鍾，於解剖台板上固定後掀開左側腹部皮膚，可看到脾臟，換眼科剪鑷，在超凈台中用無菌手術剪剪開腹膜，取出脾臟置於已盛有10ml不完全培養基的平皿中，輕輕洗滌，並細心剝去周圍結締組織。將脾臟移入另一盛有10ml不完全培養基的平皿中，用彎頭鑷子或裝在1ml注射器上的彎針頭輕輕擠壓脾臟（也可用注射器內芯擠壓脾臟），使脾細胞進入平皿中的不完全培養基。用吸管吹打數次，製成單細胞懸液。為了除去脾細胞懸液中的大團塊，可用200目銅網過濾。收獲脾細胞懸液，1000r/min離心5-10分鍾，用不完全培養基離心洗滌1-2次，然後將細胞重懸於10ml不完全培養基混勻，取上述懸液，加台酚藍染液作活細胞計數後備用。通常每隻小鼠可得1×108-2.5×108個脾細胞，每隻大鼠脾臟可得5×108-10×108脾細胞。
⑷ 飼養細胞（Feeder cells）的制備
在細胞融合後選擇性培養過程中，由於大量骨髓瘤細胞和脾細胞相繼死亡，此時單個或少數分散的雜交瘤細胞多半不易存活，通常必須加入其他活細胞使之繁殖，這種被加入的活細胞稱為飼養細胞。飼養細胞促進其他細胞增殖的機制尚不明了，一般認為它們可能釋放非種屬特異性的生長刺激因子，為雜交瘤細胞提供必要的生長條件；也可能是為了滿足新生雜交瘤細胞對細胞密度的依賴性。
常用的飼養細胞有胸腺細胞、正常脾細胞和腹腔巨噬細胞。其中以小鼠腹腔巨噬細胞的來源及制備較為方便，且有吞噬清除死亡細胞及其碎片的作用，因此使用最為普遍。其制備方法如下：
按上述采小鼠脾細胞的方法將小鼠致死、體表消毒和固定後，用消毒剪鑷從後腹掀起腹部皮膚，暴露腹膜。用酒精棉球擦拭腹膜消毒。用注射器注射10ml不完全培養基至腹腔，注意避免穿入腸管。右手固定注射器，使針頭留置在腹腔內，左手持酒精棉球輕輕按摩腹部1分鍾，隨後吸出注入的培養液。1000r/min離心5-10分鍾，棄上清。先用5ml HAT培養基將沉澱細胞懸浮，根據細胞計數結果，補加HAT培養基，使細胞濃度為2×105/ml，備用。通常對巨噬細胞來說，96孔培養板每孔需2×104個細胞，24孔板每孔需105細胞。每隻小鼠可得3-5×106個細胞，因此一隻小鼠可供兩塊96孔板的飼養細胞。也可在細胞融合前1-2天制備並培養飼養細胞，這樣使培養板孔底先鋪上一層飼養細胞層。做法是，將上述細胞懸液加入96孔板，每孔0.1ml（相當於2滴），然後置37℃ 6% CO2的培養箱中培養。
⑸ 細胞融合與雜交瘤細胞的選擇性培養
細胞融合的程序已報道的有很多種，這里介紹的是作者所在實驗室常用的一種。
A、將1×108脾細胞與2×107-5×107骨髓瘤細胞SP2/0-Ag14混合於一支50ml融合管中，補加不完全培養基至30ml，充分混勻。
B、 1000r/min離心5-10分鍾，將上清盡量吸凈。
C、在手掌上輕擊融合管底，使沉澱細胞鬆散均勻;置40℃水浴中預熱。
D、用1ml吸管在1分鍾左右（最佳時間為45秒）加預熱至40℃的50% PEG（PH 8.0）1ml，邊加邊輕輕攪拌。
E、用10ml吸管在90秒內加20-30ml預熱至37℃的不完全培養基；20-37℃靜置10分鍾。
F、 1000r/min 5分鍾；棄去上清。
G、 加入5ml HAT培養基，輕輕吹吸沉澱細胞，使其懸浮並混勻，然後補加含腹腔巨噬細胞的HAT培養基至80-100ml。
H、分裝96孔細胞培養板，每孔0.10-0.15ml；分裝24孔板，每孔1.0-1.5ml；然後將培養板置37℃，6% CO2培養箱內培養。
I、 5天後用HAT培養基換出1/2培養基。
J、 7-10天後用HT培養基換出HAT培養基；（第14天後可用普通完全培養基）。
L、經常觀察雜交瘤細胞生長情況，待其長至孔底面積1/10以上時吸出上清供抗體檢測。
3、雜交瘤細胞篩選
雜交瘤細胞在融合後2周左右即可篩選，即把分泌所需抗體的雜交瘤孔從眾多的孔中選出來，通常也稱為抗體檢測。抗體檢測的方法很多，通常根據所研究的抗原和實驗室的條件而定。但作為雜交瘤篩選的抗體檢測方法必須具有快速、准備、簡便，便於一次處理大量樣品等特點。因為往往有幾百個樣品需要在短短幾個小時就報告結果，以便決定雜交瘤細胞的取捨。所以選用抗體檢測方法的原則是快速、敏感、特異、可靠、花費小和節省人力。一般說來，在融合之前就必須建立好抗體檢測方法，並克服可能存在的問題。另一個重要問題是抗體檢測方法所需要的「動力學范圍」，即檢出背景以上的最強與最弱信號之比，依所用的檢測抗原是否純凈而定。如雜交瘤抗體是針對純化的蛋白質抗原的，100%的抗原參與反應，一個陽性/陰性判別系統就夠了。另一方面，如果雜交瘤抗體是針對細胞表面微量的蛋白抗原，檢測系統可能需要能測出微弱信號，則動力學范圍至少應為10：1，最好為100：1。另外，檢測方法的選擇還受所需雜交瘤抗體的類型和預定的用途的影響。結合補體的抗體可以用基於細胞毒性反應的檢測方法來選出。如需結合A蛋白的雜交瘤抗體，就要用結合蛋白A的檢測方法。
下面簡要介紹幾種常用的抗體檢測方法：
⑴ 免疫酶技術
免疫酶技術是將抗原抗體反應的特異性和酶對底物顯色反應的高效催化作用有機結合而成的免疫學技術。由於它特異性強，靈敏度高，現已廣泛用於篩選和鑒定單抗。
A、器材和試劑
a. 包被緩沖液：
碳酸鹽緩沖液：取0.2mol/L Na2CO3 8ml，0.2mol/L NaHCO3 17ml混合，再加75ml蒸餾水，調PH至9.6。
Tris-HCl緩沖液（PH8.0，0.02mol/L）：取0.1mol/L Tris 100ml，0.1mol/L HCl 58.4ml混合，加蒸餾水至1000ml。
b. 洗滌緩沖液（PH7.2的PBS）：KH2PO4 0.2g，KCl 0.2g，Na2HPO4"12H2O 2.9g，NaCl 8.0g，Tween-20 0.5ml，加蒸餾水至1000ml。
c. 稀釋液和封閉液：牛血清白蛋白（BSA）0.1g，加洗滌液至100ml；或用洗滌液將小牛血清配成5-10%使用。
d. 酶反應終止液（2mol/L H2SO4）：取蒸餾水178.3ml，滴加濃硫酸（98%）21.7ml。
e. 底物緩沖液（PH5.0，磷酸鹽-檸檬酸緩沖液）：取0.2mol/L Na2HPO4 25.7ml，0.1ml/L檸檬酸24.3ml，再加50ml蒸餾水。檸檬酸溶液及配成的底物緩沖液不穩定，易形成沉澱，因此一次不宜配製過多。
f. 底物使用液：
OPD底物使用液（測490nm的OD值）：OPD 5mg，底物緩沖液10ml，3% H2O2 0.15ml。
TMBS或TMB底物使用液（測450nm的OD值）：TMBS或TMB（1mg/ml）1.0ml，底物緩沖液10ml，1% H2O2 25ul。
ABTS底物使用液（測410nm的OD值）：ABTS 0.5mg，底物緩沖液1ml，3% H2O2 2ul。
g. 抗體對照：以骨髓瘤細胞培養上清作為陰性對照，以免疫鼠血清作為陽性血清。
h. 抗原：可溶性抗原：盡量純化，以獲得高特異性。
病毒感染的傳代細胞或全菌抗原。
淋巴細胞等懸液。
i. 酶標抗鼠抗體或酶標SPA或其他類似試劑。
j. 細胞固定液：-20℃丙酮；或丙酮-甲醛固定液：Na2HPO4 100mg，KH2PO4 500mg，蒸餾水150ml，丙酮225ml，甲醛125ml；或丙酮-甲醛溶液（1;1）；或-20℃甲醇。
k. 聚苯乙烯微孔板：40孔、96孔、或條孔；硬板或軟板均可使用。
l. 酶聯免疫閱讀儀；或光鏡。
m. 吸管、加樣器及水浴箱、離心機等。
B、 可溶性抗原的酶聯免疫吸附試驗（ELISA）
a. 純化抗原用包被液稀釋至1-20ug/ml。
b. 以50-100ul/孔量加入酶標板孔中，置4℃過夜或37℃吸附2小時。
c. 棄去孔內的液體，同時用洗滌液洗3次，每次3-5分鍾，拍干。
d. 每孔加200ul封閉液4℃過夜或37℃封閉2小時；該步驟對於一些抗原，可省略。
e. 洗滌液洗3次；此時包被板可-20℃或4℃保存備用。
f. 每孔加50-100ul待檢雜交瘤細胞培養上清，同時設立陽性、陰性對照和空白對照；37℃孵育1-2小時；洗滌，拍干。
g. 加酶標第二抗體，每孔50-100ul，37℃孵育1-2小時，洗滌，拍干。
h. 加底物液，每孔加新鮮配製的底物使用液50-100ul，37℃10-30分鍾。
i. 以2mol/L H2SO4終止反應，在酶聯免疫閱讀儀上讀取OD值。
j. 結果判定：以P/N≥2.1，或P≥N 3D為陽性。若陰性對照孔無色或接近無色，陽性對照孔明確顯色，則可直接用肉眼觀察結果。
C、 全菌抗原的ELISAS
a. 新鮮培養的細菌用蒸餾水或PBS懸浮，並調整細菌濃度至1×108個/ml。必須指出，對於人畜共患病病原體需注意安全操作，最好是滅活處理。
b. 每孔中加100ul 5%戊二醛溶液（0.1mol/L NaHCO3 95ml 25%戊二醛溶液5ml），37℃作用2小時，蒸餾水洗滌3次；加上述細菌懸液50ul/孔；37-56℃烘乾；每孔加200ul封閉液4℃過夜或37℃ 2小時封閉。
c. 步驟b也可採用先每孔加50ul細菌懸液，37℃-56℃烘乾，然後用-20℃預冷的無水甲醇室溫作用15分鍾，蒸餾水洗滌3次；每孔加200ul封閉液4℃過夜或37℃ 2小時封閉。
d. 洗滌液洗3次；此時包被板可在-20℃或4℃保存備用。
e. 以下步驟同上法。
D、 用全細胞抗原的ELISA
a. 按常規方法培養細胞，接種病毒，收獲感染細胞和未感染細胞，進行細胞計數，用PBS製成適當濃度懸液。
b. 淋巴細胞懸液的制備採用新鮮外周血加肝素抗凝後，滴加於淋巴細胞分離液之上，1500rpm離心30分鍾，吸取界面細胞洗滌二次，即為新鮮淋巴細胞懸液。該細胞懸液中若仍混有紅細胞，離心後加0.83%的氯化銨溶液，室溫10分鍾，洗滌一次即可。將該細胞懸液稀釋至適當濃度。
c. 每孔加100ul上述a或b的細胞懸液，使每孔含細胞5×104個；1500r/min 15分鍾，甩去上清；室溫乾燥或吹乾後用丙酮-甲醇（1：1）4℃固定10分鍾；可4℃或-20℃保存備用。
d. 以下步驟同上法。
E、抗體捕捉ELISA試驗
本法用抗BALB/c小鼠Ig的多克隆抗體捕捉待檢樣品中的McAb，再依次加抗原、酶標多克隆抗體及底物顯色。該法是常用的ELISA中較理想的一種；其操作步驟如下：
a. 以適當濃度的純化抗鼠Ig抗體包被酶標板，每孔加100ul，37℃ 2小時或4℃過夜。
b. 洗滌、拍干後加待測的McAb樣品，37℃ 1-2小時。
c. 洗滌後加適量的抗原，37℃ 1-2小時。
d. 洗滌後加入酶標多克隆抗體，37℃ 1-2小時。洗滌後加底物顯色，判定結果。
3、細胞培養基種類及適合於何種細胞
培養某一類型細胞沒有固定的培養條件。在MEM中培養的細胞，很可能在DMEM或M199中同樣很容易生長。總之，首選MEM做粘附細胞培養、RPMI-1640做懸浮細胞培養，各種目的無血清培養的首選是AIM V培養基（SFM）。在開始進行新的細胞培養時，可以參考下表所列的條件：
細胞系 細胞類型 種 組織 推薦使用的培養基
293 成纖維細胞 人 胚胎腎 MEM, 10% 熱滅活馬血清
3T6 成纖維細胞 小鼠 胚胎 DMEM, 10% 胎牛血清
A549 上皮細胞 人 肺癌 F-12K, 10%胎牛血清
A9 成纖維細胞 小鼠 結締組織 DMEM, 10%胎牛血清
AtT-20 上皮細胞 小鼠 垂體腫瘤 F-10, 15% 馬血清和2.5% 胎牛血清
BALB/3T3 成纖維細胞 小鼠 胚胎 DMEM, 10% 胎牛血清
BHK-21 成纖維細胞 倉鼠 腎 GMEM, 10% 胎牛血清 或MEM, 10% 胎牛血清 和NEAA
BHL-100 上皮細胞 人 乳房 McCoy'5A, 10% 胎牛血清
BT 成纖維細胞 牛 鼻甲骨細胞 MEM, 10% 胎牛血清 和 NEAA
Caco-2 上皮細胞 人 結腸腺癌 MEM, 20% 胎牛血清 和NEAA
Chang 上皮細胞 人 肝臟 BME, 10% 小牛血清
CHO-K1 上皮細胞 倉鼠 卵巢 F-12, 10% 胎牛血清
Clone 9 上皮細胞 大鼠 肝臟 F-12K, 10% 胎牛血清
Clone M-3 上皮細胞 小鼠 黑素瘤 F-10, 15% 馬血清和 2.5% 胎牛血清
COS-1 成纖維細胞 猴 腎 DMEM, 10% 胎牛血清
COS-3 成纖維細胞 猴 腎 DMEM, 10% 胎牛血清
COS-7 成纖維細胞 猴 腎 DMEM, 10% 胎牛血清
CRFK 上皮細胞 貓 腎 MEM, 10% 胎牛血清 和NEAA
CV-1 成纖維細胞 猴 腎 MEM, 10% 胎牛血清
D-17 上皮細胞 狗 骨肉瘤 MEM, 10% 胎牛血清 和NEAA
Daudi 成淋巴細胞 人 淋巴瘤病人血液 RPMI-1640, 10% 胎牛血清
GH1 上皮細胞 大鼠 垂體腫瘤 F-10, 15% 馬血清和 2.5% 胎牛血清
GH3 上皮細胞 大鼠 垂體腫瘤 F-10, 15% 馬血清和2.5% 胎牛血清
H9 成淋巴細胞 人 T細胞淋巴瘤 RPMI-1640, 20% 胎牛血清
HaK 上皮細胞 倉鼠 腎 BME, 10% 小牛血清
HCT-15 上皮細胞 人 結腸直腸腺癌 RPMI-1640, 10% 胎牛血清
HeLa 上皮細胞 人 子宮頸癌 MEM, 10% 胎牛血清 和NEAA (in suspension, S-MEM)
HEp-2 上皮細胞 人 喉 癌 MEM, 10% 胎牛血清
HL-60 成淋巴細胞 人 早幼粒細胞白血病 RPMI-1640, 20% 胎牛血清
HT-1080 上皮細胞 人 纖維肉瘤 MEM, 10% HI 胎牛血清 和NEAA
HT-29 上皮細胞 人 結腸腺癌 McCoy's 5A, 10% 胎牛血清
HUVEC 內皮細胞 人 臍帶 F-12K, 10% 胎牛血清 和 肝素鹽 100 ug/ ml
I-10 上皮細胞 小鼠 睾丸癌 F-10, 15% 馬血清和 2.5% 胎牛血清
IM-9 成淋巴細胞 人 骨髓瘤病人骨髓 RPMI-1640, 10% 胎牛血清
JEG-2 上皮細胞 人 絨毛膜癌 MEM, 10% 胎牛血清
Jensen 成纖維細胞 大鼠 肉瘤 McCoy's 5A, 5% 胎牛血清
Jurkat 成淋巴細胞 人 淋巴瘤 RPMI-1640, 10% 胎牛血清
K-562 成淋巴細胞 人 骨髓性的白血病 RPMI-1640, 10% 胎牛血清
KB 上皮細胞 人 口腔癌 MEM, 10% 胎牛血清 和NEAA
KG-1 骨髓白細胞 人 紅白血病病人骨髓 IMDM, 20% 胎牛血清
L2 上皮細胞 大鼠 肺 F-12K, 10%胎牛血清
L6 大鼠 骨骼肌成肌細胞 DMEM, 10% 胎牛血清
LLC-WRC 256 上皮細胞 大鼠 癌 Medium 199, 5% 馬血清
McCoy 成纖維細胞 小鼠 未知 MEM, 10% 胎牛血清
MCF7 上皮細胞 人 乳腺癌 MEM, 10% 胎牛血清 NEAA, 10ug/ml 胰島素
WEHI-3b 類巨噬細胞 小鼠 骨髓單核細胞白血病 DMEM, 10% 胎牛血清
WI-38 上皮細胞 人 胚胎肺 BME, 10% 胎牛血清
WISH 上皮細胞 人 羊膜 BME, 10% 胎牛血清
WS1 人 胚胎皮膚 MEM, 10% 胎牛血清 和NEAA
XC 上皮細胞 大鼠 肉瘤 MEM, 10% 胎牛血清 和NEAA
Y-1 上皮細胞 小鼠 腎上腺瘤 F-10, 15% 馬血清和 2.5% 胎牛血清
4、hbl-100細胞用什麼培養基
培養某一類型細胞沒有固定的培養條件。在MEM中培養的細胞，很可能在DMEM或M199中同樣很容易生長。總之，首選MEM做粘附細胞培養、RPMI-1640做懸浮細胞培養，各種目的無血清培養的首選是AIM V培養基（SFM）。在開始進行新的細胞培養時，可以參考下表所列的條件：
細胞系 細胞類型 種 組織 使用的培養基
293 成纖維細胞 人 胚胎腎 MEM, 10% 熱滅活馬血清
3T6 成纖維細胞 小鼠 胚胎 DMEM, 10% 胎牛血清
A549 上皮細胞 人 肺癌 F-12K, 10%胎牛血清
A9 成纖維細胞 小鼠 結締組織 DMEM, 10%胎牛血清
AtT-20 上皮細胞 小鼠 垂體腫瘤 F-10, 15% 馬血清和2.5% 胎牛血清
BALB/3T3 成纖維細胞 小鼠 胚胎 DMEM, 10% 胎牛血清
BHK-21 成纖維細胞 倉鼠 腎 GMEM, 10% 胎牛血清 或MEM, 10% 胎牛血清 和NEAA
BHL-100 上皮細胞 人 乳房 McCoy'5A, 10% 胎牛血清
BT 成纖維細胞 牛 鼻甲骨細胞 MEM, 10% 胎牛血清 和 NEAA
Caco-2 上皮細胞 人 結腸腺癌 MEM, 20% 胎牛血清 和NEAA
Chang 上皮細胞 人 肝臟 BME, 10% 小牛血清
CHO-K1 上皮細胞 倉鼠 F-12, 10% 胎牛血清
Clone 9 上皮細胞 大鼠 肝臟 F-12K, 10% 胎牛血清
Clone M-3 上皮細胞 小鼠 黑素瘤 F-10, 15% 馬血清和 2.5% 胎牛血清
COS-1 成纖維細胞 猴 腎 DMEM, 10% 胎牛血清
COS-3 成纖維細胞 猴 腎 DMEM, 10% 胎牛血清
COS-7 成纖維細胞 猴 腎 DMEM, 10% 胎牛血清
CRFK 上皮細胞 貓 腎 MEM, 10% 胎牛血清 和NEAA
CV-1 成纖維細胞 猴 腎 MEM, 10% 胎牛血清
D-17 上皮細胞 狗 骨肉瘤 MEM, 10% 胎牛血清 和NEAA
Daudi 成淋巴細胞 人 淋巴瘤病人血液 RPMI-1640, 10% 胎牛血清
GH1 上皮細胞 大鼠 垂體腫瘤 F-10, 15% 馬血清和 2.5% 胎牛血清
GH3 上皮細胞 大鼠 垂體腫瘤 F-10, 15% 馬血清和2.5% 胎牛血清
H9 成淋巴細胞 人 T細胞淋巴瘤 RPMI-1640, 20% 胎牛血清
HaK 上皮細胞 倉鼠 腎 BME, 10% 小牛血清
HCT-15 上皮細胞 人 結腸直腸腺癌 RPMI-1640, 10% 胎牛血清
HeLa 上皮細胞 人 子宮頸癌 MEM, 10% 胎牛血清 和NEAA (in suspension, S-MEM)
HEp-2 上皮細胞 人 喉 癌 MEM, 10% 胎牛血清
HL-60 成淋巴細胞 人 早幼粒細胞白血病 RPMI-1640, 20% 胎牛血清
HT-1080 上皮細胞 人 纖維肉瘤 MEM, 10% HI 胎牛血清 和NEAA
HT-29 上皮細胞 人 結腸腺癌 McCoy's 5A, 10% 胎牛血清
HUVEC 內皮細胞 人 臍帶 F-12K, 10% 胎牛血清 和 肝素鹽 100 ug/ ml
I-10 上皮細胞 小鼠 睾丸癌 F-10, 15% 馬血清和 2.5% 胎牛血清
IM-9 成淋巴細胞 人 骨髓瘤病人骨髓 RPMI-1640, 10% 胎牛血清
JEG-2 上皮細胞 人 絨毛膜癌 MEM, 10% 胎牛血清
Jensen 成纖維細胞 大鼠 肉瘤 McCoy's 5A, 5% 胎牛血清
Jurkat 成淋巴細胞 人 淋巴瘤 RPMI-1640, 10% 胎牛血清
K-562 成淋巴細胞 人 骨髓性的白血病 RPMI-1640, 10% 胎牛血清
KB 上皮細胞 人 口腔癌 MEM, 10% 胎牛血清 和NEAA
KG-1 骨髓白細胞 人 紅白血病病人骨髓 IMDM, 20% 胎牛血清
L2 上皮細胞 大鼠 肺 F-12K, 10%胎牛血清
L6 大鼠 骨骼肌成肌細胞 DMEM, 10% 胎牛血清
LLC-WRC 256 上皮細胞 大鼠 癌 Medium 199, 5% 馬血清
McCoy 成纖維細胞 小鼠 未知 MEM, 10% 胎牛血清
MCF7 上皮細胞 人 癌 MEM, 10% 胎牛血清 NEAA, 10ug/ml 胰島素
WEHI-3b 類巨噬細胞 小鼠 骨髓單核細胞白血病 DMEM, 10% 胎牛血清
WI-38 上皮細胞 人 胚胎肺 BME, 10% 胎牛血清
WISH 上皮細胞 人 羊膜 BME, 10% 胎牛血清
WS1 人 胚胎皮膚 MEM, 10% 胎牛血清 和NEAA
XC 上皮細胞 大鼠 肉瘤 MEM, 10% 胎牛血清 和NEAA
Y-1 上皮細胞 小鼠 腎上腺瘤 F-10, 15% 馬血清和 2.5% 胎牛血清
5、捐獻造血幹細胞的動員劑有沒有副作用，臨床應用多少年了？
有副作用，只是屬於可承受范圍。
動員劑：
在捐獻造血幹細胞之前幾天，會打一種叫粒細胞集落刺激因子，促進造血幹細胞大量生長釋放到外周血中。關於幹細胞捐獻者術前應用粒細胞集落刺激因子的問題。對可能產生的並發症存在顧慮。解釋見下：
這種葯物的全名叫：重組人粒細胞集落刺激因子注射液（rhG-CSF），是利用基因重組技術生產的。它可選擇性的作用於粒系造血祖細胞，促進其增殖、分化，並可增加外周血中性粒細胞的數目和功能。在每個正常人體內都存在，是調節骨髓中粒系造血的主要細胞因子之一。
該葯物進入臨床應用已十餘年，其有效性及安全性已得到了充分的驗證。健康成人應用該葯24小時後，其在尿中的濃度即已降至檢出界限以下。連續多日用葯，監測其血清葯物濃度，未發現蓄積現象。
在該葯的動物試驗中，給小鼠一次注射相當於臨床劑量近1000倍的葯物，未發現有急性中毒反應。長期大量應用（4～13周）可出現ALP升高，脾重增加。但停葯後即恢復。
其臨床應用中報告的不良反應主要有以下：發熱（1.3％）；骨痛、腰痛（1.2％）；肝功能異常（0.5％）；皮疹（0.3％）等等。有極少數可發生過敏反應（發生率<1/4000），經積極抗過敏治療能迅速消失。對於高敏體質者必要時可先做皮試。
對於再生障礙性貧血及先天性中性粒細胞減少症患者，有可能轉化為骨髓增生異常綜合征（MDS）或急性髓性白血病。對於MDS患者有可能促進幼稚細胞增殖，轉化為髓性白血病。
需要強調的是：1、其副反應總的發生率約4.9%，並不比我們日常應用的其他葯物多或者嚴重。2、其誘導產生白血病細胞的基礎，是患者本身已有血液病。對於我們正常人而言，這種可能性並不存在。
【葯品名稱】
通用名：重組人粒細胞巨噬細胞集落刺激因子注射液
商品名：
英文名：Recombinant Human Granulocyte/Macrophage Colony-stimulating Factor Injection
漢語拼音：Chongzu Ren Lixibao Jushixibao Jiluocijiyinzi Zhusheye
主要組成成分：重組人粒細胞巨噬細胞集落刺激因子
【性狀】
本品為無色透明的液體。
【葯理毒理】
1.葯理作用：重組人粒細胞巨噬細胞集落刺激因子（rhGM-CSF）作用於造血祖細胞，促進其增殖和分化，其重要作用是刺激粒、單核巨噬細胞成熟，促進成熟細胞向外周血釋放，並能促進巨噬細胞及噬酸性細胞的多種功能。
2.毒理作用：
2.1急性毒性：結果表明，以最大濃度給小鼠靜脈注射和皮下注射，未能求出LD50。其最大耐受量達5000μg/kg，相當於人臨床用量（5～10μg/kg）的500～1000倍，觀察14天，皮下注射和腹腔注射兩種給葯途徑，動物均未見有明顯行為異常，生長良好，毛色光澤，二便正常，無動物死亡。
2.2大鼠長期毒性：用90隻Wister大鼠分為大劑量組（600μg/kg/日）和rhGM-CSF小劑量組（300μg/kg/日），每天皮下注射1次rhGM-CSF，連續五周，結果表明：試驗組大鼠的活動、行為、進食情況、體重、大小便等均無異常。血液學和血液生化檢查，各項指標及重要臟器肉眼和病理組織學檢查，均未見異常改變。恢復性觀察，也未發現延遲毒性反應。
2.3犬長期毒性試驗：健康雜種犬rhGM-CSF300μg/kg/日和150μg/kg/日，每天皮下注射1次，連續五周，結果表明：rhGM-CSF對犬的活動、行為、進食情況、體重、二便、重要臟器重量均未見有明顯影響。血液學和血液生化檢查，各項指標正常，重要臟器肉眼和病理組織學檢查，均未見異常改變。恢復性觀察，未發現延遲毒性反應。
2.4生殖毒性試驗——致畸敏感期毒性試驗：rhGM-CSF大劑量（600μg/kg/日）使大鼠胎仔的體重和身長發育明顯抑制，表明rhGM-CSF大劑量對大鼠胚胎發育有顯著毒性。rhGM-CSF100μg/kg/日和20μg/kg/日對胎仔外觀、體重、身長、尾長、內臟和骨骼等的影響，與生理鹽水對照組比較，均無明顯差異，未見畸形。表明rhGM-CSF100μg/kg/日和20μg/kg/日對大鼠胚胎發育無明顯毒性。
2.5皮膚刺激試驗：在家兔和豚鼠，rhGM-CSF15μg/0.1ml皮下注射，每日上午一次，連續七天，未觀察到皮膚紅斑和水腫，表明rhGM-CSF無皮膚刺激。
【葯代動力學】
志願者皮下注射3、10、20μg/kg和靜脈注射3至30μg/kg可觀察到血濃度峰值和曲線下面積（AUC）隨劑量的增大而增高。皮下注射本品，在3～4小時血濃度達到峰值。靜脈注射本品的清除半衰期為1～2小時，皮下注射則為2～3小時。小鼠皮下注射125I-GM-CSF後，腎臟含量最高，其次是胃和血液，心臟和骨骼中含量較低。在24小時內有45%葯物經尿液排出，其中20%以原型排出，48小時內66～86%的葯物經尿液排泄。
【適應症】
1.預防和治療腫瘤放療或化療後引起的白細胞減少症。
2.治療骨髓造血機能障礙及骨髓增生異常綜合征。
3.預防白細胞減少可能潛在的感染並發症。
4.使感染引起的中性粒細胞減少的恢復加快。
【用法用量】
化療葯物給葯結束後24～48小時起皮下或靜脈注射本品，每日1次，本品的用量和用葯時間應根據患者化療的強度和中性粒細胞下降的程度決定，對化療強度較大或粒細胞下降較明顯的患者以2.5μg/kg/日的劑量連續用葯7天以上較為適宜，至中性粒細胞恢復至5000/mm3停葯。如所用化療葯物劑量較低，估計造成的骨髓抑制不太嚴重者，可考慮使用較低劑量預防中性粒細胞減少，以1.25μg/kg/日的劑量用葯，至中性粒細胞數穩定於安全范圍。對化療後中性粒細胞已明顯降低的患者（中性粒細胞數＜1000mm3），以5μg/kg/日的劑量用葯至中性粒細胞恢復至5000/mm3以上，穩定後終止本品治療並監視病情。
【不良反應】
本品的安全性與劑量和給葯途徑有關。大部分不良反應多屬輕到中度，嚴重的反應罕見。最常見的不良反應為發熱、寒戰、惡心、呼吸困難、腹瀉，一般的常規對症處理便可使之緩解；其次有皮疹、胸痛、骨痛和腹瀉等。據國外報道，低血壓和低氧綜合征在首次給葯時可能出現，但以後給葯則無此現象。不良反應發生多於靜脈推注和快速滴注以及劑量大於32μg/kg/日有關。
【禁忌】
1.對rhGM-CSF或該制劑中任何其他成分有過敏史的病人以及對大腸桿菌表達的其他制劑有過敏史者禁用。
2.自身免疫性血小板減少性紫癜的病人。
【注意事項】
1.本品應在專科醫生指導下使用。病人對rhGM-CSF的治療反應和耐受性個體差異較大，為此應在治療前及開始治療後定期觀察外周血白細胞或中性粒細胞，血小板數據的變化。血象恢復正常後立即停葯或採用維持劑量。
2.本品屬蛋白質類葯物，用前應檢查是否發生渾濁，如有異常，不得使用。
3.本品不應與抗腫瘤放、化療葯同時使用，如要進行下一療程的抗腫瘤放、化療，應停葯至少48小時後，方可繼續治療。
4.孕婦、高血壓患者及有癲癇病史者慎用。
5.使用前仔細檢查，如發現瓶子有破損，溶解不完全者均不得使用，溶解後的葯劑應1次用完。
【孕婦及哺乳期婦女用葯】
孕婦及哺乳期婦女使用本品的安全性尚未建立，應慎重使用。
【兒童用葯】
慎用。
【老年患者用葯】
觀察患者的狀態，注意用量和間隔，慎重給葯。
【葯物相互作用】
1.本品與化療葯物同時使用，可加重骨髓毒性，因而不宜與化療葯物同時使用，應於化療結束後24～48小時使用。
2.本品可引起血漿白蛋白降低，因此，同時使用具有血漿白蛋白高結合的葯物應注意調整葯物的劑量。
3.注射丙種球蛋白者，應間隔1個月以上再接種本品。
【葯物過量】
文獻報道，本品劑量達30μg/kg時，其不良反應的發生與常規用量相比，有明顯增加和相關，一般停葯後可自行緩解。
【規格】
75μg/支、150μg/支、300μg/支
6、大鼠骨髓來源巨噬細胞原代培養需要貼壁2個小時就換液嗎
大鼠骨髓來源巨噬細胞原代培養需要貼壁2個小時就換液
系統名稱應明確標明：酶的底物及所催化的反應性質.如果有兩個底物都應寫出,中間用冒號隔開.此外,底物的構型也應寫出.
如谷丙轉氨酶,其系統名稱為L-丙氨酸：α-酮戊二酸氨基轉移酶；
再例如對催化下列反應酶的命名.?
ATP+D-葡萄糖→ADP+D-葡萄糖-6-磷酸
該酶的正式系統命名是：ATP：葡萄糖磷酸轉移酶,表示該酶催化從ATP中轉移一個磷酸到葡萄糖分子上的反應.它的分類數字是：E.C.2.7.1.1,E.C代表按國際酶學委員會規定的命名,第1個數字(2)代表酶的分類名稱(轉移酶類),第2個數字(7)代表亞類(磷酸轉移酶類),第3個數字(1)代表亞亞類(以羥基作為受體的磷酸轉移酶類),第4個數字(1)代表該酶在亞-亞類中的排號(D葡萄糖作為磷酸基的受體).
如果其中一個底物是水,可以省去不寫,如D-葡萄糖-δ-內酯水解酶,不必寫成D-葡萄糖-δ-內酯：水水解酶.
7、大鼠胸腺正常重多少呢
胸腺
胸腺位於胸骨後面，緊靠心臟，呈灰赤色，扁平橢圓形，分左、右兩葉，由淋巴組織構成。青春期前發充良好，青春期後逐漸退化，為脂肪組織所代替。
胸腺是造血器官，能產生淋巴細胞，並運送到淋巴結和脾臟等處。這種淋巴細胞對機體的細胞免疫具有重要作用。
生長激素和甲狀腺素能刺激胸腺生長，而性激素則促使胸腺退化。
胸腺肽是胸腺產生的一種蛋白質和多肽激素，能刺激T淋巴細胞的成熟，平衡和調節免疫功能，是一種與機體的細胞免疫有密切關系的激素。人到成年後，胸腺逐漸萎縮，胸腺素分泌急劇減少或缺失，此時為提高免疫功能減弱的機體，補充胸腺素是所必須的。
免疫系統
參考資料：
胸腺
1．胸腺的結構 胸腺在胚胎早期由鰓溝外胚層和咽囊內胚層的上皮發生而成，故其早期原基是含有外胚層和內胚層的上皮組織；在淋巴幹細胞遷入後，漸變為一種特殊的淋巴組織。小兒胸腺為薄片狀粉紅色軟組織，分左右兩葉，表面有薄層結締組織被膜（capsule）。被膜結締組織成片狀伸入胸腺實質形成小葉間隔（interlobualr septum），將胸腺分成許多不完整的小葉。每個小葉分為皮質和髓質兩部分。皮質內胸腺細胞密集，故著色較深；髓質含較多的上皮細胞，故著色較淺。小葉髓質常在胸腺深部相互連接（圖9－6）。
圖9－6 小兒胸腺
（1）皮質（cortex）：皮質以上皮細胞為支架，間隙內含有大量胸腺細胞和少量巨噬細胞等（圖9－7，9－8）。
圖9－7 胸腺內細胞分布模式圖
圖9-8 大鼠胸腺皮質電鏡像 ×7800
（白求恩醫科大學尹昕、朱秀雄教授供圖）
胸腺上皮細胞：皮質的上皮細胞有被膜下上皮細胞（subcapsular epithelial cell）和星形上皮細胞（stellate epithelial cell）兩種。被膜下上皮細胞與結締組織相鄰的一側呈完整的扁平上皮狀，有基膜，相鄰細胞間有許多橋粒連接,細胞的另一側則有一些突起。有的細胞的胞質較豐富，胞質內含有一些內吞的胸腺細胞（圖9－7），類似胸腺分離細胞中所見的哺育細胞（nurse cell）。哺育細胞為一大的圓形或橢圓形細胞，胞質內含有數個乃至數十個胸腺細胞，有的還進行有絲分裂，它們是Th細胞的前身。被膜下上皮細胞能分泌胸腺素和胸腺生成素。星形上皮細胞即通常所稱的上皮性網狀細胞（epithelial reticular cell），細胞多分支狀突起，突起間以橋粒相互連接成網，細胞表面標志不同於被膜下上皮細胞，但與胸腺小體上皮細胞的相同。表面具有大量的MHC抗原。此種細胞不分泌激素，其質膜緊貼胸腺細胞，有誘導胸腺細胞發育分化的作用。
胸腺細胞（thymocyte）：即T細胞的前身，它們密集於皮質內，占胸腺皮質細胞總數的85％～90％。淋巴幹細胞遷入胸腺後，先發育為體積較大的早期胸腺細胞（約佔3％）。它們經增殖後成為較小的普通胸腺細胞，其特點為開始出現T細胞抗原受體（TCR），且漸表達CD4和CD8抗原，此種細胞約占胸腺細胞總數的75％，它們對抗原尚無應答能力。普通胸腺細胞正處於被選擇期，凡能與機體自身抗原相結合或與自身MHC抗原不相容的胸腺細胞（約佔95％）將被滅活或淘汰，少數選定的細胞則繼續分化，從而建立符合機制需要的淋巴細胞TCR庫。進一步成熟的普通胸腺細胞，其CD4和CD8之中有一種增強，另一種減弱或消失，結果CD4＋的細胞約佔2／3，CD8＋的細胞佔1／3。
（2）髓質（mella）：髓質內含大量胸腺上皮細胞和一些成熟胸腺細胞、交錯突細胞和巨噬細胞。上皮細胞有兩種（圖9－7）：①髓質上皮細胞（mellary epithelial cell），呈球形或多邊形，胞體較大，細胞間以橋粒相連，間隙內有少量胸腺細胞。髓質上皮細胞是分泌胸腺激素的主要細胞。②胸腺小體上皮細胞（thymic corpuscle epithelial cell），它構成胸腺小體（thymic corpuscle），胸腺小體直徑30～150μm，散在分布於髓質內，由上皮細胞呈同心圓狀包繞排列而成，是胸腺結構的重要特徵。小體外周的上皮細胞較幼稚，細胞核明顯，細胞可分裂；近小體中心的上皮細胞較成熟，胞質中含有較多的角蛋白，核漸退化；小體中心的上皮細胞則已完全形質化，細胞呈嗜酸性染色，有的已破碎呈均質透明狀，中心還常見巨噬細胞或噬酸性粒細胞。胸腺小體上皮細胞不分泌激素，功能未明，但缺乏胸腺小體的胸腺不能培育出T細胞。髓質內的胸腺細胞數量雖少，但均已成熟，並具有免疫應答的能力。髓質內還有少數散在分布的交錯突細胞和巨噬細胞，Th細胞常群集於交錯突細胞附近。巨噬細胞也參與胸腺內微環境的形成，其分泌物能促進胸腺細胞的分化。
（3）胸腺的血液供應及血胸腺屏障：幾條小動脈從胸腺四周穿越被膜進入小葉間隔，在皮質與髓質交界處形成微動脈，並發出許多毛細血管分布於皮質。這些毛細血管又匯入皮髓質交界處的毛細血管後微靜脈，其中有部分微靜脈是高內皮的，它是胸腺內淋巴細胞進出血流的主要通道。髓質的毛細血管常為有孔型，匯入微靜脈後經小葉間隔及被膜出胸腺。據統計，大鼠胸腺靜脈血液中的淋巴細胞數量約為動脈血的1.5倍。
實驗表明血液內的大分子物質不易進入胸腺皮質內，說明皮質的毛細血管及其周圍結構具有屏障作用，稱為血－胸腺屏障（blood-thymus barrier）（圖9－9）。血-胸腺屏障由下列數層構成：①連續性毛細血管，其內皮細胞間有完整的緊密連接；②內皮基膜；③血管周隙，其中含有巨噬細胞；④上皮基膜；⑤一層連續的上皮細胞。
圖9－9 血-胸腺屏障結構模式圖
近來發現胸腺被膜內的毛細血管是有孔的，血內含有的各種自身抗原分子易經此滲出，進入靠近被膜的胸腺皮質內。這些微量的自身抗原與未成熟的普通胸腺細胞的相應抗原受體結合後，可導致該細胞的滅活或淘汰，從而使胸腺產生的某些T細胞對自身抗原具有免疫耐受性或無應答性。此外；髓質血管的血管周隙較大，其中有多種細胞成分，如T細胞、B細胞、漿細胞、肥大細胞、嗜酸性粒細胞、成纖維細胞和脂肪細胞等；大的血管周隙內還可含有毛細淋巴管，內含較多的淋巴細胞，可能是胸腺輸出淋巴細胞的另一條通路。
2．胸腺的功能 胸腺是培育和選擇T細胞的重要器官。胸腺上皮細胞分泌的胸腺素（thymosin）和胸腺生成素（thymopoietin）均能促進胸腺細胞的分化，巨噬細胞和交錯突細胞也參與胸腺內微環境的形成。胸腺培育出的各種處女型T細胞，經血流輸送至周圍淋巴器官和淋巴組織。
胸腺有明顯的年齡性變化。幼兒期的胸腺較大，重約27g，此後緩慢地退化，皮質漸變薄，胸腺細胞數量漸少，皮質和髓質的境界漸不明顯，胸腺小體增大，脂肪細胞漸增多。85歲以後的胸腺，皮質已很少。此外，胸腺還是一個易受損害的器官，急性疾病、腫瘤、大劑量照射或大劑量固醇類葯物等均可導致胸腺的急劇退化，胸腺細胞大量死亡與空竭；但病癒或消除有害因子後，胸腺的結構可漸恢復。若切除新生小鼠的胸腺，該動物即缺乏T細胞，不能排斥異體移植物；周圍淋巴器官及淋巴組織中無次級淋巴小結出現，機體產生抗體的能力也明顯下降。若在動物出生後數周再切除胸腺，此時因已有大量處女型T細胞遷至周圍淋巴器官和淋巴組織內，已能行使一定的免疫功能，故短期內看不出影響，但機體的免疫力仍會逐漸下降。若給切除胸腺的新生動物移植一片胸腺，則能明顯改善該去胸腺動物的免疫缺陷狀態。
胸腺內有豐富的神經末梢，它們終止於胸腺細胞之間或上皮細胞及巨噬細胞附近。胸腺細胞表面有多種神經遞質的受體，表明神經對胸腺細胞的發育分化有調節作用。 胸腺 胸腺能分泌多種肽類物質，如胸腺素（thymosin）、胸腺生長素（thymopoietin）等，它們促進T細胞分化成熟。 三、前列腺素 前列腺素（prostaglandin,PG）是廣泛存在於動物和人體內的一組重要的組織激素。PG的化學結構一般是具有五元環和兩條側鏈的二十碳不飽和脂肪酸。根據其分子結構的不同，可把PG分為A、B、D、E、F、H、I等型。 細胞膜的磷脂化在磷脂酶A2的作用下，生成PG的前體棗花生四烯酸。花生四烯酸在環氧化酶的催化下，形成不穩定的環內過氧化物棗PGG2，隨後又轉變為PGH2。PGH2在異構酶或還原酶的作用下，分別形成PGE2或PGF2α。PGG2與PGH2又可前列素合成酶的作用下，轉變為前列環素（PGI2），在血栓烷合成酶的作用下變成血栓烷A2（TXA2）（圖11-23） 圖11-23 體內主要前列腺素的合成途徑 另外，花生四烯酸在脂氧化酶的作用下，形成5-氫過氧酸，進而被代謝生成白三烯。 PG在體內代謝極快，除PGI2外，經過肺和肝被迅速降解滅活，在血漿中的半衰期公為1-2min。一般認為，PG不屬於循環激素，而是在組織局部產生和釋放，並對局部功能進行調節的組織激素。 PG的生物學作用極為廣泛而復雜，幾乎對機體各個系統的功能活動均有影響。例如，由血小板產生的TXA2，能使血小板聚集，還有能使血管收縮的作用。相反，由血管內膜產生PHG2，能抑制血小板聚集，並有舒張血管的作用。PGE2有明顯的抑制胃酸分泌的作用，它可能是胃液分泌的負反饋抑制物，PGE2可增加腎血流量，促進排鈉利尿。此外，PG對體溫調節、神經系統、以及內分泌與生殖均有影響。
成年人胸腺有重要的免疫作用
新生命網站編譯最近，得克薩斯大學西南醫學中心的研究者發現，胸腺在成年期繼續發揮作用並且影響接受異源幹細胞移植的病人的恢復。論文發表在美國血液協會的最新一期《血液》雜志上。研究者觀察了白血病患者接受異源骨髓或幹細胞移植治療後胸腺所起的作用。這些病人因化療而損失大量T細胞。得克薩斯大學西南醫學中心內科助教授DanielDouek博士說，"我們的疑問是：經過同種異體移植後胸腺的確幫助再生新的免疫系統么？結果是肯定的，它再生了新的免疫系統；特別是小孩，胸腺的貢獻巨大。"胸腺產生T細胞。T細胞對抗感染而幫助移植病人恢復。然後研究者觀察影響胸腺分泌的主要因素，"目的是如果有什麼可以抑制胸腺分泌的話，我們能夠嘗試臨床上防止其發生的方法。"我們發現隨著年齡的增長，胸腺的分泌減少，正如我們所預料的那樣。最重要的是我們發現移植物抗宿主病完全阻斷了胸腺新細胞的生成。"他說，"如果要重建作用廣泛的新免疫系統你必須想辦法消除移植物抗宿主病。"他補充說，用抑制免疫葯物能治療移植物抗宿主病，並且研究者還發現那些葯物並不抑制胸腺的分泌。這就意味著移植物抗宿主病可以早期且積極的治療而不損壞胸腺的分泌。Douek說下一步是要研究重建免疫系統的途徑，目的是研製用於臨床實驗的各種化合物，並為促進免疫系統重建的臨床實驗打下基礎。以前的研究顯示胸腺只在兒童期具有活性爾後萎縮，但是1998年得克薩斯大學西南醫學中心的研究者在《自然》上報道說胸腺在人的一生都持續產生T細胞。他們的研究對象是被HIV摧毀免疫系統的病人。去年發表在《柳葉刀》雜志上的一項研究中，研究者研究了年齡從34到66歲的接受自體同源骨髓移植的病人（化療後接受了自己的骨髓），發現他們的胸腺再生了免疫系統。最近的研究涉及接受了更為普通的同種異體移植的病人。他們是來自4個醫療中心的67名從嬰兒到成人的病人。
知道「免疫大王」是誰嗎？
在人的胸骨上端，左右兩肺之間，有一個火柴盒大小的黃灰色組織，這就是胸腺。以前人們把胸腺和闌尾（盲腸）一樣看待，認為是一個沒有用的、在進化過程中還沒有來得及完全退化掉的器官。隨著近半世紀來免疫學的進展，人們才認識到了胸腺在人體免疫功能中的重要作用，而把它譽為免疫大王。要知道胸腺在免疫中的大王地位，只要看看作為特異免疫主力軍的淋巴細胞的作用和它們與胸腺的關系就清楚了。
血液中的淋巴細胞，70-80%為T淋巴細胞（簡稱T細胞）。它們原是骨髓里生長出的微小白色細胞，被血液送到胸腺里，受胸腺激素的培育，成為成熟的、但還沒有免疫功能的T細胞，再把它們送到脾臟、淋巴系統和其它器官，讓它們在那裡受胸腺激素的影響進一步長大，隨時准備抵抗各種對人體有害的敵人。胸腺激素還能提高淋巴細胞的殺傷能力，誘導B細胞（也是一種淋巴細胞）成熟。
T細胞按其功能可分為：
輔助性T細胞協助活化B細胞產生抗體，也可協助殺傷性T細胞及巨噬細胞發揮免疫功能。
抑制性T細胞對各種T細胞和B細胞都有抑製作用，調節和控制免疫反應，維持免疫自穩性（即免疫耐受性）。
功能性T細胞是被特異抗原刺激後分化增殖的致敏T細胞。可以直接殺傷異已物。
記憶性T細胞連同記憶性B細胞一起，是在搞原刺激後，保存特異抗原信息的淋巴細胞，壽命可長達數十年。當它們再次接受與原來相同的抗原刺激後，就可以分增殖為對付抗原的功能性T細胞或能產生抗體的漿細胞。
殺傷性T細胞殺傷異已物時需要抗體參與。
自然殺傷性T細胞殺傷異已物時不需要抗體和預先致敏的淋巴細胞的參與。有免疫監視功能，對殺傷腫瘤起重要作用。
在胚胎時期，胸腺比心臟，甚至比肺還要大，在青春時期達到最大，以後開始逐漸退化，到中年時減小到10克左右。胸腺組織逐漸由脂肪代替，到50歲之後，胸腺激素的分泌就完全停止。胸腺這個免疫大王，在建立、訓練了一支免疫大軍之後，就功成造退了。
胸腔異常可導致膽固醇升高
美中醫學網（www.uschinahealth.com）記者報道，人們總是把血清中膽固醇升高歸罪於不良的飲食習慣。殊不知血清膽固醇含量和人體脖子上一個稱之為胸腺的功能有密切關系。
胸腺分泌一系列激素參與包括膽固醇在內的機體有機物質的代謝調節。專家們指出，胸腺性疾病是引起高膽固醇血症中僅次於飲食的主要原因之一。胸腺功能低下的人有25％到50％患有不同程度的高膽固醇血症；反之，有一成的高膽固醇血症患者伴有胸腺功能低下。因此當人們猛然發現自己有高膽固醇血症時，應該先去找醫生檢查一下自己的胸腺功能是否正常。
為此，美國臨床內分泌醫師協會近期發起了一個稱之為「用脖子來控制膽固醇」的計劃，旨在讓人們了解胸腺與膽固醇之間的聯系。
人在深度睡眠中會製造出生長素（HGH),其分泌的方式是用脈沖方式進行的，當人們進入40歲以後，或因精神壓力，以及疾病造成深度睡眠減少時，生長素的分泌就會減少或停止分泌，科學家們發現35歲以上得人，生長素分泌比年輕時減少了將近75%，因此導致了人體內臟各器官的衰退和委縮，同時也導致了大多數人的福，脂肪堆積，肌肉鬆弛，免疫功能下降等，這都與生長素分泌減少有直接的關系。
生物學家指出，人的壽命應是性成熟期的5-7倍，若以20歲作為界限，人可以活到100-140歲，然而大多數人活不到這一年齡，主要是35歲以後生長素的分泌減少，使人體各臟、腑器官的委縮、尤其是胸腺器官的萎縮而造成免疫功能降低，人上了年紀以後，受疾病感染的機會更多，容易被病魔奪去生命，感染上多種因免疫功能低下而導致的惡性疑難病症，如：癌症、心腦血管疾病、糖尿病等。
醫學研究證明，胸腺這一重要的人體氣官位於胸骨柄後方，縱隔上部，緊貼在氣管的前面，在胚胎發育早期，胸腺與甲狀腺同出一源，人出生後胸腺許迅速生長，並漸行移居於胸骨後，出生時的胸腺約15克 ，由於少兒時生長素分泌量豐富，到青春期達到高峰，使胸腺這一器官達到30-40克，以後逐漸退化胸腺特別敏感於生長素（HGH),人在35歲以後生長素的分泌量減少，所以胸腺就逐漸退化，因此胸腺是人體中「壽命」較短的器官，進入老年後可逐漸被脂肪組織代替。
胸腺髓質微環境是培養T細胞的理想場所，T細胞被譽為人體健康衛士，它在細胞免疫反映中具有神通廣大的本領，能直接殺傷進入人體的病原微生物和腫瘤細胞以及體內的異種毒素。T細胞產生於骨髓，是原始血細胞（造血幹細胞）的後裔，原始血細胞隨血液循環移居於胸腺，增殖分化成淋巴細胞，這些細胞的強者進入胸腺髓質內健康成長，獲得了細胞免疫的重要功能。
可是人過35歲以後，胸腺漸行退化，最後壽終正寢。胸腺的退化與人的衰老密切相關，因為胸腺萎縮之後，人體內的T細胞大大減少，免疫系統和免疫功能也隨之減弱，因此人體對B細胞的抑製作用也減弱了許多，B細胞往往不按需要產生抗體，不分敵我，胡亂攻擊正常細胞，從而使人致病，造成免疫系統的紊亂。當代醫學已證明很多老年性疾病與胸腺萎縮所致的T細胞減少有非常重要的因果關系。
退休的胸腺：有關T細胞發生的研究 王卉, 朱乃碩（上海復旦大學 生命科學學院，上海 200433）
胸腺是T細胞發育的主要場所。隨著年齡的增長，胸腺不斷退化，經典的理論認為胸腺只在生物發育早期行使功能。最新的發現卻認為胸腺在成年後仍具有活性[1] 。AIDS病研究的有關進展有力地支持了這一觀點。
1.T細胞在胸腺中的發育
胸腺是T細胞分化成熟並接受教育選擇的中樞免疫器官。胸腺在胚胎早期發育成熟，自出生開始不斷萎縮退化，老年人的胸腺充斥著脂肪組織，被認為沒有活性，發育早期摘除胸腺會帶來嚴重的免疫功能缺陷。胸腺分泌多種細胞因子促進T細胞的成熟，其上皮細胞富含多種類型抗原，為T細胞的發育提供了重要的微環境。
進入胸腺的CD4ˉCD8ˉ雙陰性T細胞(double negative T cell)發育為CD4＋ CD8＋ 雙陽性T細胞(double positive T cell)時發生T細胞受體(T cell receptor，TCR)基因的重排，T細胞與上皮細胞的主要組織相容性復合體(major histocompatibility complex, MHC)抗原相遇，接受陽性選擇，獲得MHC限制性識別能力，無MHC識別能力的的T細胞被清除，繼而CD4或CD8單陽性T細胞(single positive T cell)與皮質髓質交界處的巨噬細胞(MΦ)和樹突狀細胞相遇，接受陰性選擇，刪除那些與自身抗原起反應的T細胞，獲得免疫耐受性。上述過程可刪除90%以上的胸腺細胞，保留下來的T細胞進入外周淋巴循環，稱為初生T細胞(naive T cell),並在之後的免疫應答中進一步分化為效應T細胞(effect T cell)和記憶T細胞(memory T cell)[2]。
隨著器官移植和AIDS病研究的發展，人們發現胸腺在免疫重建中可以產生新的初生T細胞，稱為胸腺依賴途徑(thymus-dependent pathway)。主要的反對意見認為這種T細胞來源於外周T細胞的增殖(peripheral T cell expansion), 稱為非胸腺依賴途徑(thymus-independent pathway)，成為近年來的研究熱點。
2.研究初生T細胞的新方法
(1)由Douek等發展的T細胞基因重組產物分析法
TCR基因表達為占絕大多數的αβTCR和佔一小部分的γδTCR。位點δ位於α基因座，在Vα和Jα之間，TCRA和TCRB基因在重排中產生被切除DNA片段的游離環,即T細胞受體基因重組環（TCR-rearrangement excision circles，TRECs）。TRECs在等位基因上完全切除，並在外周組織中的T細胞中穩定存在，它不參與細胞染色體DNA的復制，並隨著細胞分裂被逐代稀釋。因此，TRECS水平可以反映胸腺內TCR基因的重組活性以及胸腺外T細胞的增殖效率。TCR重排的多樣性必將伴隨TRECs的多樣性。但在所有有功能的αβTCR基因重排中，必須發生TCRA座位中TCRD的切除，分別產生信號連結TREC——sjTREC(signal-joint TREC)和編碼連結TREC——cjTREC(coding-joint TREC),可作為初生T細胞的普遍標記[3]。
Douek研究小組通過此法發現TRECs水平隨年齡增長呈遞減趨勢，即使某些對象已達70高齡但TRECs始終處於可探測水平，而先天性胸腺缺乏病人的TRECs水平則始終低於正常人群。說明胸腺能夠持續發揮功能直至成年。
(2)McCune等發展的重氫法
McCune等將重氫標記的葡萄糖靜脈注射入人體。葡萄糖是脫氧核糖的前體，可在T細胞復制時摻入DNA。隨著T細胞的分裂，標記DNA不斷被未標記DNA取代，於不同時間采血樣分析，即可測量T細胞的產生率和平均壽命。McCune等發現AIDs病患者的CD4T細胞壽命顯著縮短，在對患者施以抗逆轉錄病毒治療(highly active antiretroviral therapy, HAART)後，T細胞的產生有明顯提高，但其壽命無增長，顯示出T細胞的重新生成在免疫重建中的重要作用[4]。
（3）胸腺切除方法
胸腺切除是研究胸腺功能的傳統方法，但目前仍有廣泛的應用。Haynes分別研究了胸腺遭切除和胸腺未切除的AIDS病人，發現前者在免疫重建中表現出一定的缺陷[5]。Berzines在新生胸腺組織的移植中發現，T細胞的輸出率（export rate）和外周T細胞數量始終保持不變，而新遷入外周循環的胸腺細胞(recent thymic emigrants, RTEs)的表面標記與已定居T細胞不同，且RTEs的輸出率與胸腺細胞輸出率吻合良好。Berzines認為胸腺可以不斷產生RTEs替代外周組織中的定居T細胞，並藉此維持人體T細胞庫(T cell repertoire)的多樣性[6]。
3.在有關AIDs病的研究中發現胸腺可以重建人體T細胞庫
（1）TRECs水平分析
人體一旦感染HIV病毒，TRECs水平即迅速下降。對患者進行HAART治療後，伴隨HIV RNA拷貝數的減少，TRECs水平穩步增長，停止治療後TRECs水平相應下降。鑒於初生T細胞的增殖不可能如此高速，而HIV對初生T細胞並無易感傾向，Douek認為更可能的解釋是HIV破壞了胸腺的功能，抑制了前體胸腺細胞的生成，或者誘導了將表達CD4 T細胞的死亡，從而減少了初生T細胞的產量[1]。
（2）AIDS病人胸腺組織形態觀察
對因AIDS死亡者作屍體解剖，發現其缺乏胸腺活性組織[5]，胸腺細胞表現出死亡表徵，髓質部分缺乏表達CD4和CD8的T細胞[7]。McCune發現新的HIV感染者具有高表達的胸腺組織,說明胸腺對HIV的感染能夠作出反應。McCune認為對某些而不是全部患者而言，其胸腺功能甚至有所加強，因HIV感染而導致的T細胞的消亡誘發了某種胸腺成熟機制，將某種殘留休眠T細胞(dormant T cell renament)喚醒[8]。
Steinmann[9]和Bofill[10]認為，真正的胸腺不會隨著年齡的增長充斥著脂肪組織，在重症肌無力中也不會被炎症細胞所充斥，而只是存在於周邊脈管空隙中(perivasculer)，被埋藏於這些組織之中。盡管他們的學說顯得難以接受,Haynes卻認為有一定道理，他對死亡前兩天的AIDS病人作CT檢查，可以找到淋巴組織，但在隨後的屍體解剖中卻沒有發現類似活性組織，取而代之的是脈管組織中的一些外周滲透細0胞，Haynes認為CT顯示的淋巴組織只是一種假象，實際上是一些滲透了的炎症細胞，他提出一種假設，胸腺是由外周淋巴成分（存在於脈管組織中）和中心淋巴成分（存在於真正的胸腺皮質中）共同組成的[5]。（3）一種反對學說
主要的反對者比如 Pakker等認為，AIDS病人在治療中所表現的免疫重建源於外周淋巴組織中再分配時生成的某種移居T細胞(sequestered T cell)的釋放，因為98%的淋巴細胞留貯於外周淋巴組織中，人們有理由認為大部分CD4和CD8 T細胞被捕捉入受到感染並由於強烈的細胞毒作用而引起炎症的淋巴組織中，一旦HAART治療減輕了病毒負載，炎症作用將緩解，細胞毒作用恢復正常水平，已移居的T細胞被釋放[11]。
成熟T細胞和初生T細胞的表面標志有所不同，前者表現為CD45＋ RO＋，後者表現為CD45＋ RA＋，此學說的支持者認為在AIDs病人中能探測到初生T細胞的存在是由於成熟T細胞表面標志的反轉。
Pakker的研究小組還發現淋巴組織產生的初生T細胞在外周循環中的重駐(repopulation)是一個漫長的過程，CD45＋ RA＋的增長引起CD4＋ T細胞的重駐，這一現象在治療開始後12個月方可見，同樣的現象發生於骨髓移植(bone-marrow transplantation, BMT)中[11]。
(4)對非胸腺依賴途徑的質疑
Douek認為AIDs病人的免疫重建應歸功於胸腺依賴途徑，因為沒有數據可以支持如Pakker所說的退引細胞的保留庫的存在。Douek在先天性胸腺發育不良者的少量外周T細胞中探測不到TRECs的存在，進一步證明盡管前T細胞有可能在淋巴結中進行TCR基因的重組，但肯定不能對TRECs的總體水平產生重大影響[3]。
Haynes研究了切除胸腺的AIDs病患者，發現其恢復效率明顯低於未切除胸腺的病人；Hayens同時發現AIDs患者在接受HAART治療前後T細胞庫多樣性並無顯著變化[5]。考慮到Zhang等對HAART誘導的淋巴結修復機制和淋巴T細胞恢復作出的闡釋[12]以及Douek的結論，Haynes認為胸腺和外周淋巴組織對T細胞庫的重建具有同樣重要的意義，並認為開始時CD4＋ CD45RA＋和CD4＋ T細胞的增殖來源於非胸腺依賴途徑[5]。
4.在組織移植中發現支持胸腺依賴途徑的證據
最主要的證據來自於骨髓移植。Doumont-Girard通過研究接受移植物抗宿主病(graft versus host disease，GVHD)治療的病人（這些病人因葯物治療體內T細胞水平幾乎接近於0），發現在最初的6個月內，T細胞的增長幾乎全部來自外周T細胞的增殖，表達CD45＋ RO＋ 表面標記，其TCR庫多樣性保持不變；CD4＋ RA＋的最初出現在6個月之後，伴隨著TCR庫多樣性的波動，Dumont認為這種波動由CD4＋ RA＋ T細胞的多樣性決定。顯然，CD4＋ RA＋ T細胞是從胸腺中新遷入的。在所有的病人中，青少年的T細胞恢復速度明顯高於成人，說明胸腺確實在免疫重建中扮演一定的角色[13]。
Mackall在皮膚移植手術中發現，胸腺被切除的女性病人不會出現針對其男同胞皮膚新抗原（neoantigen）而發生的排斥反應，並表現出對一般抗原應答的衰退，Mackall認為此現象無法僅僅通過外周淋巴細胞在免疫重建中的擴增解釋，其必然與胸腺的持續活性相關[8]。
目前，非胸腺依賴途徑和胸腺依賴途徑之爭依然沒有得到圓滿解決。CD45＋ RA＋ 和CD45＋ RO＋表面標記的不同究竟是來源於產生時的不同，還是後者向前者的逆轉；HIV病毒究竟感染胸
8、骨髓巨噬細胞是半量換液還是全量換液
大鼠骨髓來源巨噬細胞原百代培養需要貼壁2個小時就換液
系統名稱應明確標明：酶的底物及所催化的反應性質.如果有兩個底物都應寫出,中間用冒號隔開.此外,底物的構型也應寫出.
如谷丙轉氨酶,其系統名稱為L-丙氨酸：α度-酮戊二酸氨基轉移酶；
再例如對催化下列反應酶的命名.?
ATP+D-葡萄糖→ADP+D-葡萄糖-6-磷酸
該酶的正式系統命名是：ATP：葡萄糖磷酸轉移酶,表示知該酶催化從ATP中轉移一個磷酸到葡萄糖分子上的道反應.它的分類數字是：E.C.2.7.1.1,E.C代表按國際酶學委員會規定的命名,第1個數字(2)代表酶的分類名稱(轉移酶類),第2個數字(7)代表亞類(磷酸轉移酶類),第3個數字(1)代表亞亞類(以羥基作專為受體的磷酸轉移酶類),第4個數字(1)代表該酶在亞-亞類中的排號(D葡萄糖作為磷酸基的受體).
如果其中一個底物是水,可以省去不寫,如D-葡萄糖-δ-內酯水解酶,不必寫成D-葡萄糖-δ-內酯：水屬水解酶.