1、小鼠骨髓細胞染色體標本制備和觀察實驗報告
首先要提前2小時向小鼠注射秋水仙素，處死小鼠，剪下四肢，剔除肉等，剪碎骨，加生理鹽水，離心取細胞（離心管底部），再經低滲處理，染色，滴冰片，鏡檢。很麻煩，具體的你可以去圖書館查閱相關資料(動物染色體制備)。
2、做小鼠骨髓移植照光有什麼要注意的
balb/c小鼠照8個Gy應該沒有問題的，致死劑量是8.5
注意事項
1、小鼠是幾周的，受體鼠最好是8周齡以上的
2、雄的比較容易活下來
3、骨髓單個核輸注每隻尾靜脈1－2X10的7次方，你細胞是不是輸得太少了
4、另外照完得老鼠要按裸鼠那樣飼養，就是在SPF動物房養，用消過毒的籠子，食水都要消毒的
5、食用的水要用酸化水，PH值3－4的
6、如果小鼠照射完看著狀態不好，可以腹腔給一點沒有血清得培養基，如1640
7，想知道小鼠是不是造血衰竭死亡，你最好把剛剛死亡得小鼠骨髓切片，HE染色看一下，以前我碰見過小鼠別得細胞都恢復了，就是巨核恢復得慢，小鼠出血死掉。
8、當然放射源得數字不準，你可以摸一下照射得劑量梯度，如果照射的空白組死亡，而打同基因骨髓細胞的小鼠還活著，就是最佳的照射劑量了，
3、求助小鼠骨髓移植問題
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4、制備小鼠骨髓染色體標本過程中有哪幾個主要步驟影響製片結果
在制備小鼠骨髓細胞染色體標本過程中以下幾個步驟需要注意：
提前3-4小時候注射秋水仙素，時間太長或者太短都會影響染色體中期的數目和形態。
在低滲過程中時間和吹打都很重要，低滲過度染色體膨脹，染色後肥肥的，低滲時間不過染色後染色體顏色很深看不出條帶。
滴片，如果是教學的實驗,要求玻片是冰的,而且要傾斜，滴的高度一般在25-30CM，滴完要過酒精燈，讓固定液蒸發。滴的數量不要太多否則會重疊.如果是醫院里的染色體製片有專門的滴片機。
小鼠骨髓細胞染色體標本製作：
原理：
由於小鼠四肢骨內骨髓細胞中的造血幹細胞是生成各種血細胞和原始細胞，具有高度的分裂能力，本實驗採用這一材料，通過前處理，低滲，固定，製片，染色等步驟製得染色體標本，可觀察到許多處於分裂中期的染色體，可以進行染色體組型分析；
試劑、試劑盒：秋水仙素、姬姆薩染液、固定液、低滲液、生理鹽水；
儀器、耗材：天平、離心機、恆溫培養箱、顯微鏡；
實驗步驟
一、材料和方法
1. 材料：小白鼠。
2. 設備：天平，離心機，恆溫培養箱，顯微鏡。
3. 葯品：秋水仙素，姬姆薩染液，固定液，低滲液，生理鹽水。
二、步驟
秋水仙素處理--取骨髓--低滲處理--固定--離心--再固定--再離心--滴片--染色--鏡檢--封片。
5、骨髓瘤 培養
雜交瘤技術在具體操作上，各實驗室使用的程序不盡一致。本節中介紹的方法是作者所在實驗室採用的、實踐證明成熟的程序，該程序適合國內大多數實驗室。
在開展雜交瘤技術制備單抗之前，培養骨髓瘤和雜交瘤細胞必須具備下列主要儀器設備：超凈工作台、CO2恆溫培養箱、超低溫冰箱（-70℃）、倒置顯微鏡、精密天平或電子天平、液氮罐、離心機（水平轉子，4000r/min）、37℃水浴箱、純水裝置、濾器、真空泵等。其需要的主要器械包括：100ml、50ml、25ml細胞培養瓶，10ml、1ml刻度吸管，試管，滴管（彎頭、直頭），平皿，燒杯，500ml、250ml、100ml鹽水瓶，青黴素小瓶，10ml、5ml、1ml注射器等，96孔、24孔細胞培養板，融合管（50ml圓底帶蓋玻璃或塑料離心管），眼科剪刀，眼科鑷，血細胞計數板，可調微量加樣器（~50ul，~200ul，~1000ul），彎頭針頭，200目篩網，小鼠固定裝置等。此外，雜交瘤細胞的篩選與檢測的儀器設備，依據檢測單抗的方法不同而各異，請參閱本節有關部分。
淋巴細胞雜交瘤技術的主要步驟包括：動物免疫、細胞融合、雜交瘤細胞的篩選與單抗檢測、雜交瘤細胞的克隆化、凍存、單抗的鑒定等，圖6-1概括了淋巴細胞雜交瘤技術研製單抗的主要過程。
1、動物免疫
(1) 抗原制備制備單克隆抗體的免疫抗原，從純度上說雖不要求很高，但高純度的抗原使得到所需單抗的機會增加，同時可以減輕篩選的工作量。因此，免疫抗原是越純越好，應根據所研究的抗原和實驗室的條件來決定。一般來說，抗原的來源有限，或性質不穩定，提純時易變性，或其免疫原性很強，或所需單抗是用於抗原不同組分的純化或分析等，免疫用的抗原只需初步提純甚至不提純，但抗原中混雜物很多，特別是如果這些混雜物的免疫原性較強時，則必須對抗原進行純化。檢測用抗原可以是與免疫抗原純度相同，也可是不同的純度，這主要決定於所用篩檢方法的種類及其特異性和敏感性。
(2) 免疫動物的選擇根據所用的骨髓瘤細胞可選用小鼠和大鼠作為免疫動物。因為，所有的供雜交瘤技術用的小鼠骨髓瘤細胞系均來源於BALB/c小鼠，所有的大鼠骨髓瘤細胞都來源於LOU/c大鼠，所以一般的雜交瘤生產都是用這兩種純系動物作為免疫動物。但是，有時為了特殊目的而需進行種間雜交，則可免疫其他動物。種間雜交瘤一般分泌抗體的能力不穩定，因為染色體容易丟失。就小鼠而言，初次免疫時以8-12周齡為宜，雌性鼠較便於操作。
(3) 免疫程序的確定免疫是單抗制備過程中的重要環節之一，其目的在於使B淋巴細胞在特異抗原刺激下分化、增殖，以利於細胞融合形成雜交細胞，並增加獲得分泌特異性抗體的雜交瘤的機會。因此在設計免疫程序時，應考慮到抗原的性質和純度、抗原量、免疫途徑、免疫次數與間隔時間、佐劑的應用及動物對該抗原的應答能力等。沒有一個免疫程序能適用於各種抗原。現用的免疫程序中多數是參照制備常規多克隆抗體的方法。表6-1列舉了目前常用的免疫程序。免疫途徑常用體內免疫法包括皮下注射、腹腔或靜脈注射，也採用足墊、皮內、滴鼻或點眼。最後一次加強免疫多採用腹腔或靜脈注射，目前尤其推崇後者，因為可使抗原對脾細胞作用更迅速而充分。在最後一次加強免疫後第3天取脾融合為好，許多實驗室的結果表明，初次免疫和再次免疫應答反應中，取脾細胞與骨髓瘤細胞
融合，特異性雜交瘤的形成高峰分別為第4天和第22天，在初次免疫應答時獲得的雜交瘤主要分泌IgM抗體，再次免疫應答時獲得的雜交瘤主要分泌IgG抗體。筆者體會陽性雜交瘤出現的高峰與小鼠血清抗體的滴度並無明顯的平行關系，且多在血清抗體高峰之前。因此，為達到最高的雜交瘤形成率需要有盡可能多的漿母細胞，這在最後一次加強免疫後第3天取脾進行融合較適宜。已有人報道採用脾內免疫，可提高小鼠對抗原的免疫反應性，且節省時間，一般免疫3天後即可融合。
表6-1 不同免疫抗原的免疫程序
免疫原特性 抗原量 接種次數 間隔時間 單抗的特性 抗體滴度 親和性
免疫原性強（如細胞、細菌和病毒等） 106-107個細胞或1-10ug 2-4 2-4周 高 中等至強
免疫原性中等 10-100ug 2-4 2-4周 中等或高中等或強
免疫原性弱 A.20-400ug 2-4 隨後 2-3 每月 2-3月中等 強
B.10-50ug 其後 200-400ug 2 其後 4 每月 每天 中等 中等
C.10-100ug 2 其後 4 其後「休息」 最後加強 每月 10天 1-2月
中等 中等或強
體內免疫法適用於免疫原性強、來源充分的抗原，對於免疫原性很弱或對機體有害（如引起免疫抑制）的抗原就不適用了。如果制備人單克隆抗體幾乎不大可能採用體內免疫法。因此，針對這些情況，可採用體外免疫。所謂體外免疫就是將脾細胞（或淋巴結細胞，或外周血淋巴細胞）取出體外，在一定條件下與抗原共同培養，然後再與骨髓瘤細胞進行融合。其基本方法是取4-8周齡BALB/c小鼠的脾臟，製成單細胞懸液，用無血清培養液洗滌2-3次，然後懸浮於含10%小牛血清的培養液中，再加入適量抗原（可溶性抗原0.5-5ug/ml，細胞抗原105-106個細胞/ml）和一定量的BALB/c小鼠胸腺細胞培養上清液；在37℃，6%CO2濃度下培養3-5天，再分離脾細胞與骨髓瘤細胞融合。
2、細胞融合
（1） 主要試劑的配製
a、 細胞培養基雜交瘤技術中使用的細胞培養基主要有RPMI-1640或DMEM（Dulberco Modified Eagles Medium）兩種基礎培養基，具體配製方法按廠家規定的程序，配好後過濾除菌（0.22um），分裝，4℃保存。
"不完全RPMI-1640培養基：RPMI-1640培養基原液96ml
100×L.G.溶液1ml
雙抗溶液1ml
7.5% NaHCO3溶液1-2ml
HEPES溶液1ml
"不完全DMEM培養基：DMEM 13.37g
超純水或四蒸水980ml
NaHCO3 3.7g
雙抗溶液10ml
100×L.G.溶液10ml
用1N HCl調試PH至7.2-7.4，過濾除菌，分裝4℃保存。
"完全RPMI-1640或DMEM培養基：不完全RPMI-1640或DMEM培養基80ml
小牛血清15-20ml
用於骨髓瘤細胞SP2/0和建株後的雜交瘤細胞培養。
"HT培養基：完全RPMI-1640或DMEM培養基99ml
HT貯存液1ml
"HAT培養基：完全RPMI-1640或DMEM培養基98ml
HT貯存液1ml
A貯存液1ml
b、 氨基喋呤（A）貯存液（100×，4×10-5mol/L） : 稱取1.76mg氨基喋呤（Aminopterin MW 440.4），溶於90ml超純水或四蒸水中，滴加1mol/L NaOH 0.5ml中和，再補加超純水或四蒸水至100ml。過濾除菌，分裝小瓶（2ml/瓶），-20℃保存。
c、次黃嘌呤和胸腺嘧啶核苷（HT）貯存液(100×,H:10-2mol/L，T：1.6×10-3mol/L): 稱取136.1mg次黃嘌呤(Hypoxanthine,MW 136.1)和38.8mg胸腺嘧啶核苷(Thymidine,MW 242.2)，加超純水或四蒸水至100ml，置45-50℃水浴中使完全溶解，過濾除菌，分裝小瓶（2ml/瓶），-20℃凍存。用前可置37℃加溫助溶。
d、 L-谷氨醯胺（L.G.）溶液（100×，0.2mol/L） : 稱取2.92g L-谷氨醯胺（L-glutamine，MW 146.15），用100ml不完全培養液或超純水（或四蒸水）溶解，過濾除菌，分裝小瓶（4-5ml/瓶），-20℃凍存。
e、 青、鏈黴素（雙抗）溶液（100×）: 取青黴素G（鈉鹽）100萬單位和鏈黴素（硫酸鹽）1g，溶於100ml滅菌超純水或四蒸水中，分裝小瓶（4-5ml/瓶），-20℃凍存。
f、 7.5% NaHCO3溶液 : 稱取分析純NaHCO3 7.5g，溶於100ml超純水或四蒸水中，過濾除菌，分裝小瓶（4-5ml/瓶），蓋緊瓶塞，4℃保存。
g、 HEPES溶液（1mol/L）: 稱取23.83g HEPES（N-2-Hydroxyethylpiperazine-N，-2-ethanesulfonic acid，N-2-羥乙基哌嗪- N，-2-乙基磺酸，MW 238.3）溶於100ml超純水或四蒸水中，過濾除菌，分裝小瓶（4-5ml/瓶），4℃保存。
h、 8-氮鳥嘌呤貯存液（100×）: 稱取200mg 8-氮鳥嘌呤（8-azaguanine，MW 152.1），加入4mol/L NaOH 1ml，待其溶解後，加入超純水或四蒸水99ml，過濾除菌；分裝小瓶，-20℃凍存。使用時按1%濃度加入到培養液中（即終濃度為20ug/ml）。
g. 用新配製的10% Giemsa染液染色10-20分鍾，然後用自來水洗去染液，自然乾燥。（Giemsa染液配方：Giemsa粉0.5g，甘油33ml，55-60℃保溫2小時，加甲醇33ml混勻，保存於棕色瓶內作為原液；取原液1份，加1/15mol/L PH6.8 PBS 9份，即成10% Giemsa染液）。
h. 鏡檢：選擇染色體分散好，無重疊，無失散的細胞進行觀察分析。每份標本應計數100個完整的中期核細胞，並注意觀察是否有標志染色體。
i、 50% PEG: 稱取PEG 1000 或4000 20-50g於三角瓶中，蓋緊，60-80℃水浴融化，0.6ml分裝於青黴素小瓶中，蓋緊，8磅高壓蒸汽15分鍾，-20℃存放備用。臨用前加熱融化，加等量不完全培養基，用少許7.5% NaHCO3調PH至8.0，或購買Sigma或Gibco公司現成產品。
⑵ 髓瘤細胞的准備
融合前骨髓瘤細胞維持的方式，對成功地得到雜交瘤是最為重要的。目標是使細胞處於對數生長的時間盡可能長，融合前肯定不能少於1周。凍存的細胞在復甦後要2周時間才能處於適合於融合的狀態，長過了的骨髓瘤細胞至少幾天才可能恢復。在實驗室中處於對數生長的骨髓瘤細胞維持在含10%小牛血清的培養基中，方法是用6個裝5ml培養基的培養瓶，接種10倍系列稀釋的骨髓瘤細胞。1周後到細胞相當密而又未長過的一瓶重新移植。典型的倍增時間為14-16小時。
骨髓瘤細胞懸液的制備方法如下：
a、於融合前48-36小時，將骨髓細胞擴大培養（一般按一塊96孔板的融合試驗約需2-3瓶100ml培養瓶培養的細胞進行准備）。
b、融合當天，用彎頭滴管將細胞從瓶壁瘤輕輕吹下，收集於50ml離心管或融合管內。
c、 1000r/min離心5-10分鍾，棄去上清。
d、加入30ml不完全培養基，同法離心洗滌一次。然後將細胞重懸浮於10ml不完全培養基，混勻。
e、取骨髓瘤細胞懸液，加0.4%台盼藍染液作活細胞計數後備用。細胞計數時，取細胞懸液0.1ml加入0.9ml台盼藍染液中，混勻，用血球計數板計數。計算細胞數目的公式為：每毫升細胞數=4個大方格細胞數×105/4；或每毫升細胞數=5個中方格細胞數×106/2
⑶ 脾淋巴細胞的准備
取已經免疫的BALB/c小鼠，摘除眼球采血，並分離血清作為抗體檢測時的陽性對照血清。同時通過頸脫位致死小鼠，浸泡於75%酒精中5分鍾，於解剖台板上固定後掀開左側腹部皮膚，可看到脾臟，換眼科剪鑷，在超凈台中用無菌手術剪剪開腹膜，取出脾臟置於已盛有10ml不完全培養基的平皿中，輕輕洗滌，並細心剝去周圍結締組織。將脾臟移入另一盛有10ml不完全培養基的平皿中，用彎頭鑷子或裝在1ml注射器上的彎針頭輕輕擠壓脾臟（也可用注射器內芯擠壓脾臟），使脾細胞進入平皿中的不完全培養基。用吸管吹打數次，製成單細胞懸液。為了除去脾細胞懸液中的大團塊，可用200目銅網過濾。收獲脾細胞懸液，1000r/min離心5-10分鍾，用不完全培養基離心洗滌1-2次，然後將細胞重懸於10ml不完全培養基混勻，取上述懸液，加台酚藍染液作活細胞計數後備用。通常每隻小鼠可得1×108-2.5×108個脾細胞，每隻大鼠脾臟可得5×108-10×108脾細胞。
⑷ 飼養細胞（Feeder cells）的制備
在細胞融合後選擇性培養過程中，由於大量骨髓瘤細胞和脾細胞相繼死亡，此時單個或少數分散的雜交瘤細胞多半不易存活，通常必須加入其他活細胞使之繁殖，這種被加入的活細胞稱為飼養細胞。飼養細胞促進其他細胞增殖的機制尚不明了，一般認為它們可能釋放非種屬特異性的生長刺激因子，為雜交瘤細胞提供必要的生長條件；也可能是為了滿足新生雜交瘤細胞對細胞密度的依賴性。
常用的飼養細胞有胸腺細胞、正常脾細胞和腹腔巨噬細胞。其中以小鼠腹腔巨噬細胞的來源及制備較為方便，且有吞噬清除死亡細胞及其碎片的作用，因此使用最為普遍。其制備方法如下：
按上述采小鼠脾細胞的方法將小鼠致死、體表消毒和固定後，用消毒剪鑷從後腹掀起腹部皮膚，暴露腹膜。用酒精棉球擦拭腹膜消毒。用注射器注射10ml不完全培養基至腹腔，注意避免穿入腸管。右手固定注射器，使針頭留置在腹腔內，左手持酒精棉球輕輕按摩腹部1分鍾，隨後吸出注入的培養液。1000r/min離心5-10分鍾，棄上清。先用5ml HAT培養基將沉澱細胞懸浮，根據細胞計數結果，補加HAT培養基，使細胞濃度為2×105/ml，備用。通常對巨噬細胞來說，96孔培養板每孔需2×104個細胞，24孔板每孔需105細胞。每隻小鼠可得3-5×106個細胞，因此一隻小鼠可供兩塊96孔板的飼養細胞。也可在細胞融合前1-2天制備並培養飼養細胞，這樣使培養板孔底先鋪上一層飼養細胞層。做法是，將上述細胞懸液加入96孔板，每孔0.1ml（相當於2滴），然後置37℃ 6% CO2的培養箱中培養。
⑸ 細胞融合與雜交瘤細胞的選擇性培養
細胞融合的程序已報道的有很多種，這里介紹的是作者所在實驗室常用的一種。
A、將1×108脾細胞與2×107-5×107骨髓瘤細胞SP2/0-Ag14混合於一支50ml融合管中，補加不完全培養基至30ml，充分混勻。
B、 1000r/min離心5-10分鍾，將上清盡量吸凈。
C、在手掌上輕擊融合管底，使沉澱細胞鬆散均勻;置40℃水浴中預熱。
D、用1ml吸管在1分鍾左右（最佳時間為45秒）加預熱至40℃的50% PEG（PH 8.0）1ml，邊加邊輕輕攪拌。
E、用10ml吸管在90秒內加20-30ml預熱至37℃的不完全培養基；20-37℃靜置10分鍾。
F、 1000r/min 5分鍾；棄去上清。
G、 加入5ml HAT培養基，輕輕吹吸沉澱細胞，使其懸浮並混勻，然後補加含腹腔巨噬細胞的HAT培養基至80-100ml。
H、分裝96孔細胞培養板，每孔0.10-0.15ml；分裝24孔板，每孔1.0-1.5ml；然後將培養板置37℃，6% CO2培養箱內培養。
I、 5天後用HAT培養基換出1/2培養基。
J、 7-10天後用HT培養基換出HAT培養基；（第14天後可用普通完全培養基）。
L、經常觀察雜交瘤細胞生長情況，待其長至孔底面積1/10以上時吸出上清供抗體檢測。
3、雜交瘤細胞篩選
雜交瘤細胞在融合後2周左右即可篩選，即把分泌所需抗體的雜交瘤孔從眾多的孔中選出來，通常也稱為抗體檢測。抗體檢測的方法很多，通常根據所研究的抗原和實驗室的條件而定。但作為雜交瘤篩選的抗體檢測方法必須具有快速、准備、簡便，便於一次處理大量樣品等特點。因為往往有幾百個樣品需要在短短幾個小時就報告結果，以便決定雜交瘤細胞的取捨。所以選用抗體檢測方法的原則是快速、敏感、特異、可靠、花費小和節省人力。一般說來，在融合之前就必須建立好抗體檢測方法，並克服可能存在的問題。另一個重要問題是抗體檢測方法所需要的「動力學范圍」，即檢出背景以上的最強與最弱信號之比，依所用的檢測抗原是否純凈而定。如雜交瘤抗體是針對純化的蛋白質抗原的，100%的抗原參與反應，一個陽性/陰性判別系統就夠了。另一方面，如果雜交瘤抗體是針對細胞表面微量的蛋白抗原，檢測系統可能需要能測出微弱信號，則動力學范圍至少應為10：1，最好為100：1。另外，檢測方法的選擇還受所需雜交瘤抗體的類型和預定的用途的影響。結合補體的抗體可以用基於細胞毒性反應的檢測方法來選出。如需結合A蛋白的雜交瘤抗體，就要用結合蛋白A的檢測方法。
下面簡要介紹幾種常用的抗體檢測方法：
⑴ 免疫酶技術
免疫酶技術是將抗原抗體反應的特異性和酶對底物顯色反應的高效催化作用有機結合而成的免疫學技術。由於它特異性強，靈敏度高，現已廣泛用於篩選和鑒定單抗。
A、器材和試劑
a. 包被緩沖液：
碳酸鹽緩沖液：取0.2mol/L Na2CO3 8ml，0.2mol/L NaHCO3 17ml混合，再加75ml蒸餾水，調PH至9.6。
Tris-HCl緩沖液（PH8.0，0.02mol/L）：取0.1mol/L Tris 100ml，0.1mol/L HCl 58.4ml混合，加蒸餾水至1000ml。
b. 洗滌緩沖液（PH7.2的PBS）：KH2PO4 0.2g，KCl 0.2g，Na2HPO4"12H2O 2.9g，NaCl 8.0g，Tween-20 0.5ml，加蒸餾水至1000ml。
c. 稀釋液和封閉液：牛血清白蛋白（BSA）0.1g，加洗滌液至100ml；或用洗滌液將小牛血清配成5-10%使用。
d. 酶反應終止液（2mol/L H2SO4）：取蒸餾水178.3ml，滴加濃硫酸（98%）21.7ml。
e. 底物緩沖液（PH5.0，磷酸鹽-檸檬酸緩沖液）：取0.2mol/L Na2HPO4 25.7ml，0.1ml/L檸檬酸24.3ml，再加50ml蒸餾水。檸檬酸溶液及配成的底物緩沖液不穩定，易形成沉澱，因此一次不宜配製過多。
f. 底物使用液：
OPD底物使用液（測490nm的OD值）：OPD 5mg，底物緩沖液10ml，3% H2O2 0.15ml。
TMBS或TMB底物使用液（測450nm的OD值）：TMBS或TMB（1mg/ml）1.0ml，底物緩沖液10ml，1% H2O2 25ul。
ABTS底物使用液（測410nm的OD值）：ABTS 0.5mg，底物緩沖液1ml，3% H2O2 2ul。
g. 抗體對照：以骨髓瘤細胞培養上清作為陰性對照，以免疫鼠血清作為陽性血清。
h. 抗原：可溶性抗原：盡量純化，以獲得高特異性。
病毒感染的傳代細胞或全菌抗原。
淋巴細胞等懸液。
i. 酶標抗鼠抗體或酶標SPA或其他類似試劑。
j. 細胞固定液：-20℃丙酮；或丙酮-甲醛固定液：Na2HPO4 100mg，KH2PO4 500mg，蒸餾水150ml，丙酮225ml，甲醛125ml；或丙酮-甲醛溶液（1;1）；或-20℃甲醇。
k. 聚苯乙烯微孔板：40孔、96孔、或條孔；硬板或軟板均可使用。
l. 酶聯免疫閱讀儀；或光鏡。
m. 吸管、加樣器及水浴箱、離心機等。
B、 可溶性抗原的酶聯免疫吸附試驗（ELISA）
a. 純化抗原用包被液稀釋至1-20ug/ml。
b. 以50-100ul/孔量加入酶標板孔中，置4℃過夜或37℃吸附2小時。
c. 棄去孔內的液體，同時用洗滌液洗3次，每次3-5分鍾，拍干。
d. 每孔加200ul封閉液4℃過夜或37℃封閉2小時；該步驟對於一些抗原，可省略。
e. 洗滌液洗3次；此時包被板可-20℃或4℃保存備用。
f. 每孔加50-100ul待檢雜交瘤細胞培養上清，同時設立陽性、陰性對照和空白對照；37℃孵育1-2小時；洗滌，拍干。
g. 加酶標第二抗體，每孔50-100ul，37℃孵育1-2小時，洗滌，拍干。
h. 加底物液，每孔加新鮮配製的底物使用液50-100ul，37℃10-30分鍾。
i. 以2mol/L H2SO4終止反應，在酶聯免疫閱讀儀上讀取OD值。
j. 結果判定：以P/N≥2.1，或P≥N 3D為陽性。若陰性對照孔無色或接近無色，陽性對照孔明確顯色，則可直接用肉眼觀察結果。
C、 全菌抗原的ELISAS
a. 新鮮培養的細菌用蒸餾水或PBS懸浮，並調整細菌濃度至1×108個/ml。必須指出，對於人畜共患病病原體需注意安全操作，最好是滅活處理。
b. 每孔中加100ul 5%戊二醛溶液（0.1mol/L NaHCO3 95ml 25%戊二醛溶液5ml），37℃作用2小時，蒸餾水洗滌3次；加上述細菌懸液50ul/孔；37-56℃烘乾；每孔加200ul封閉液4℃過夜或37℃ 2小時封閉。
c. 步驟b也可採用先每孔加50ul細菌懸液，37℃-56℃烘乾，然後用-20℃預冷的無水甲醇室溫作用15分鍾，蒸餾水洗滌3次；每孔加200ul封閉液4℃過夜或37℃ 2小時封閉。
d. 洗滌液洗3次；此時包被板可在-20℃或4℃保存備用。
e. 以下步驟同上法。
D、 用全細胞抗原的ELISA
a. 按常規方法培養細胞，接種病毒，收獲感染細胞和未感染細胞，進行細胞計數，用PBS製成適當濃度懸液。
b. 淋巴細胞懸液的制備採用新鮮外周血加肝素抗凝後，滴加於淋巴細胞分離液之上，1500rpm離心30分鍾，吸取界面細胞洗滌二次，即為新鮮淋巴細胞懸液。該細胞懸液中若仍混有紅細胞，離心後加0.83%的氯化銨溶液，室溫10分鍾，洗滌一次即可。將該細胞懸液稀釋至適當濃度。
c. 每孔加100ul上述a或b的細胞懸液，使每孔含細胞5×104個；1500r/min 15分鍾，甩去上清；室溫乾燥或吹乾後用丙酮-甲醇（1：1）4℃固定10分鍾；可4℃或-20℃保存備用。
d. 以下步驟同上法。
E、抗體捕捉ELISA試驗
本法用抗BALB/c小鼠Ig的多克隆抗體捕捉待檢樣品中的McAb，再依次加抗原、酶標多克隆抗體及底物顯色。該法是常用的ELISA中較理想的一種；其操作步驟如下：
a. 以適當濃度的純化抗鼠Ig抗體包被酶標板，每孔加100ul，37℃ 2小時或4℃過夜。
b. 洗滌、拍干後加待測的McAb樣品，37℃ 1-2小時。
c. 洗滌後加適量的抗原，37℃ 1-2小時。
d. 洗滌後加入酶標多克隆抗體，37℃ 1-2小時。洗滌後加底物顯色，判定結果。