1、為何基因敲除需要用到嵌合體小鼠
嵌合體是指動物的兩顆受精卵融合在一起成為一個個體並成長。遺傳學上用以指不同遺傳性狀嵌合或混雜表現的個體，亦指染色體異常類型之一。轉基因小鼠制備過程中必須要經歷的一個過程，所以基因敲除小鼠必須要用到嵌合體小鼠。
2、如何高效制備生殖系傳遞的嵌合體小鼠
嵌合體是指動物的兩顆受精卵融合在一起成為一個個體並成長。遺傳學上用以指不同遺傳性狀嵌合或混雜表現的個體，亦指染色體異常類型之一。轉基因小鼠制備過程中必須要經歷的一個過程，所以基因敲除小鼠必須要用到嵌合體小鼠。A和B都不會相互排斥,由於在胚胎期間免疫系統發生了一種稱為免疫耐受的機制,對對方的MHC抗原發生了耐受,所以雙方的免疫系統對另一方的抗原處於默認「放行」的狀態；器官移植時候,沒有這種免疫耐受的機制,只能通過化學葯物進行抑制免疫系統的方法減緩排異反應.具體可以百度「免疫耐受」、「MHC」、「HLA」等抗原.
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4、如何設計條件性基因敲除小鼠模型
小鼠和大鼠可謂是生命科學實驗室里的明星,成功的小鼠和大鼠模型可謂是生命科學的好幫手.很多人可能想自己設計或是了解條件性基因敲除小鼠,在此做個小結,供大家參考.
條件性基因敲除小鼠的設計利用了Cre/LoxP或Flipe/Frt原理.它們都是位點特異性重組酶系統.這里以Cre/LoxP系統為例.比如在待敲除的一段目標DNA序列的兩端各放置一個loxP序列,得到flox(flanked by loxP)小鼠.將flox小鼠與帶有細胞特異性表達Cre的小鼠交配繁殖,以獲得在特定細胞里把目標基因敲除掉的小鼠,即條件性基因敲除小鼠.此外,若與控制Cre表達的其他誘導系統(比如CreERT2)相結合,還可以對某一基因同時實現時空兩方面的調控.
Cre/loxP系統來源於噬菌體,可以介導位點特異的DNA重組.該系統含有兩個組成成分：一個是一段長34bp的DNA序列(LoxP序列),含有兩個13 bp的反向重復序列和一個8 bp的核心序列.LoxP的方向由中間這8個鹼基決定.這段LoxP序列是Cre重組酶識別的位點.令一個組成部分是Cre重組酶.它是由噬菌體編碼的一種由343個氨基酸組成的蛋白.Cre可以介導兩個LoxP位點的重組,從而引起兩個LoxP之間DNA序列的缺失.如果將Cre重組酶cDNA通過基因工程的手段置於組織或細胞特異性啟動子之下,可以得到Cre組織/細胞特異性表達的Cre小鼠,也叫Cre工具小鼠.跟Flox小鼠交配之後,可以得到條件性基因敲除小鼠.
所謂Flox小鼠是指在某個基因的某個外顯子兩側各放一個LoxP序列.這段序列就是Flanked by LoxP,也就叫做Flox小鼠.這種Flox小鼠一般要通過設計構建打靶載體、胚胎幹細胞重組、囊胚顯微注射、和嵌合體小鼠傳代來獲得.這種小鼠跟Cre工具小鼠交配,由於Cre的表達,介導兩個LoxP位點序列的重組,從而敲除兩個LoxP之間的序列.由於不同Cre工具小鼠的Cre表達有組織/細胞特異性,就可以達到在不同組織、細胞里特異性敲除目的基因的目標.比如上皮細胞、胸腺細胞、T細胞、B細胞、心肌細胞、腸道、肺臟等.
那如何設計條件性基因敲除小鼠呢?這里所說的設計主要是Flox小鼠的設計.所謂條件性敲除,是說除了特定細胞外,其它細胞裡面沒有任何的基因表達異常.一般情況下,不要在第一個外顯子前面放置LoxP序列.因為第一個外顯子前面一般是啟動子.放置LoxP序列有可能會破壞或改變啟動子活性.條件性敲除一般是敲掉最早引起移碼突變的外顯子.這樣的話,最好不要敲除有起始密碼子ATG的外顯子.否則的話,基因可能會利用ORF內的ATG編碼一個缺少部分N端序列的蛋白,這個蛋白很可能有全部或部分野生蛋白的功能.在選擇要敲除的外顯子的時候(各放一個LoxP在一個外顯子的兩側),該外顯子的鹼基數目不能是3N,否則新基因pre-RNA拼接得到的mRNA不能產生移碼突變.會產生一個與野生蛋白相比少了一段中間序列的新蛋白.如果一個外顯子的鹼基數目是3N+1或3N+2,敲除這個外顯子之後會產生移碼突變,就可以達到基因敲除的目的.篩選要敲除(Floxed)的外顯子的時候,一般是從最上游的外顯子開始篩選適合敲除的外顯子.需要注意的是,一般的dna分析軟體不能確定內含子和外顯子的邊界,需要仔細核對.95%以上的邊界遵循gt/ag邊界原則.也可以在Ensembl上查一個基因的外顯子和內含子.這個網站上的結果絕大部分是正確的.但也需要仔細核對.畢竟基因敲除小鼠研發是一個時間比較長的過程,需要特別小心.前期做多少的考慮都不嫌多.這些原則只是對一般課題的考慮.特殊情況需要特殊處理.
5、嵌合體小鼠的免疫系統問題
A和B都不會相互排斥， 由於在胚胎期間免疫系統發生了一種稱為免疫耐受的機制，對對方的MHC抗原發生了耐受，所以雙方的免疫系統對另一方的抗原處於默認「放行」的狀態；器官移植時候，沒有這種免疫耐受的機制，只能通過化學葯物進行抑制免疫系統的方法減緩排異反應。具體可以百度「免疫耐受」、「MHC」、「HLA」等抗原。謝謝！
6、（2014?南平模擬）科學家從129品系小鼠中成功分離出胚胎幹細胞，並注入小鼠的囊胚，形成嵌合體囊胚，育出
（1）在基因工程中，病毒常被用作運載體，可知攜帶GFP基因的病毒是導入目的基因的運載體，即作為基因表達載體．
（2）GFP基因能表達出綠色熒光蛋白，步驟②中，利用熒光顯微鏡發出綠色熒光觀察到穩定高效表達GFP的胚胎幹細胞，將其取出，進行擴增培養．
（3）步驟③中，將胚胎從子宮或輸卵管中沖出，這種胚胎的收集方法稱為沖卵．
（4）步驟⑤中，嵌合體囊胚發育成表達GFP的小鼠，此過程胚胎幹細胞可以分化形成包括生殖腺在內的各種組織．
（5）表達GFP的嵌合體小鼠和小鼠經過雜交育種，獲得子代小鼠，在經過篩選可獲得表達綠色熒光蛋白（ GFP）轉基因昆明（KM）小鼠，圖中X小鼠為KM小鼠．
故答案為：
（1）基因表達載體
（2）發出綠色熒光
（3）沖卵
（4）分化
（5）KM
7、小鼠敲除基因之後出生致死 有哪些原因
基因敲除鼠技術是上世紀80年代中後期基於DNA同源重組的原理發展起來的，Capecchi和Smithies在1987年根據同源重組（homologous recombination）的原理，首次實現了ES的外源基因的定點整合（targeted integration），這一技術稱為"基因打靶"（gene targeting）或"基因敲除"（gene knockout），利用這種ES的顯微注射就可以製作出基因敲出小鼠（KO Mice: knockout mice）;由於這一工作，Capecchi和Smithies於2007年與Evans分享了諾貝爾醫學獎。
同源重組（homologous recombination）定義：是指發生在姐妹染色單體（sister chromatin) 之間或同一染色體上含有同源序列的DNA分子之間或分子之內的重新組合。在基因敲除小鼠製作過程中，需要針對目的基因兩端特異性片段設計帶有相同片段的重組載體，將重組載體導入到胚胎幹細胞後外源的重組載體與胚胎幹細胞中相同的片段會發生同源重組，如圖1所示：
圖1.基因敲除鼠製作同源重組原理示意圖
製作流程
基因敲除小鼠技術專題
圖2.基因敲除鼠製作過程示意圖
1、Knockout載體設計與構建
根據研究項目具體情況和要求把目的基因和與細胞內靶基因特異片段同源的DNA 片段都重組到帶有標記基因(如neo 基因，TK 基因等)的載體上，成為重組的Knockout載體。
2、Knockout ES細胞篩選
Knockout載體測序驗證正確後，將載體線性化，然後電轉入ES細胞，通過載體上的正負篩選基因獲得陽性的Knockout ES克隆。選取PCR鑒定打靶載體正確插入的ES基因組DNA用於Southern Blot鑒定，將Southern Blot鑒定的Knockout ES擴大培養並液氮保存。
3、Knockout ES細胞囊胚注射得到嵌合體小鼠
擴增經鑒定插入或置換片段位置正確的Knockout ES細胞，以囊胚顯微注射的方式將一定數量的Knockout ES細胞注入特定品系小鼠囊胚中，然後將囊胚移植到假孕的小鼠子宮中。待後代小鼠出生後，通過小鼠的毛色中來源於ES細胞毛色的比例判斷嵌合程度的高低，以及該小鼠的後代中可能獲得生殖系傳遞能力。
4、由嵌合體小鼠繁殖出生殖遺傳系Knockout 小鼠
將嵌合體小鼠與適當品系的小鼠交配，後代小鼠出生後，通過PCR方式檢測小鼠是否含有打靶序列。如有，則該小鼠為具備生殖遺傳能力的Knockout小鼠(F1代鼠)。
5、Knockout小鼠生殖系傳遞鑒定
將嵌合體小鼠和適當品系野生型小鼠交配，通過後代小鼠毛色或PCR基因型鑒定的方法驗證嵌合體小鼠生殖系傳遞能力。
基因敲除常見方法
基因敲除小鼠技術專題
一、常規基因敲除鼠（Conventional Knockout）
常規基因敲除是通過基因打靶，把需要敲除的基因的幾個重要的外顯子或者功能區域用Neo Cassette 替換掉。這樣的小鼠其全身所有的組織和細胞中都不表達該基因產物。此類基因敲除鼠一般用於研究某個基因在對小鼠全身生理病理的影響，而且這個基因沒有胚胎致死性。
二、條件性基因敲除小鼠（Conditional Knockout）
條件性基因敲除小鼠是通過基因打靶，把兩個loxP位點放到目的基因一個或幾個重要的外顯子的兩邊。該小鼠和表達Cre酶小鼠雜交之前，其目的基因表達完全正常。當和組織特異性表達Cre酶的小鼠進行雜交後，可以在特定的組織或細胞中敲除該基因，而該基因在其他組織或細胞表達正常。
條件性基因敲除鼠適用范圍為：（1）該基因有胚胎致死性；（2）用於研究該基因在特定的組織或細胞中的生理病理功能。
三、基因敲入小鼠（Knockin）
基因敲入小鼠是通過基因打靶，把目的基因序列敲入到小鼠的相應基因位點，使用小鼠的表達調控元件指導目的基因表達。
此類基因敲入鼠一般用於葯物的篩選，信號通路的研究等。
獲得嵌合體及之後品系純化詳細流程:
基因敲除其他方法
基因敲除小鼠技術專題
一、ZFN技術製作基因敲除鼠
ZFN能夠識別並結合指定的基因序列位點，並高效精確地切斷。隨後細胞利用天然的DNA修復過程來實現DNA的插入、刪除和修改，這樣研究人員就能夠隨心所欲地進行基因組編輯。這在過去是無法想像的，傳統的基因敲除技術依賴細胞內自然發生的同源重組，其效率只有百萬分之一，而ZFN的基因敲除效率能達到10%。利用這些技術進行小鼠基因的定點敲除和敲入，可以把時間從一年縮短到幾個月。
這項技術中設計特異性的ZFN是最關鍵的環節，目前研究者採用計算生物學方法設計高特異性的ZFN，但ZFN的脫靶（off target），也就是把不該切的地方切了的問題仍是一個挑戰。也正因為這個原因，利用ZFN技術進行小鼠的基因修飾還無法完全取代傳統技術。
二、TALEN技術製作基因敲除鼠
TALEN 技術是一種嶄新的分子生物學工具。科學家發現，來自一種植物細菌的TAL蛋白的核酸結合域的氨基酸序列與其靶位點的核酸序列有恆定的對應關系。利用TAL的序列模塊，可組裝成特異結合任意DNA序列的模塊化蛋白，從而達到靶向操作內源性基因的目的，它克服了ZFN方法不能識別任意目標基因序列，以及識別序列經常受上下游序列影響等問題，而具有ZFN相等或更好的靈活性，使基因操作變得更加簡單方便。然而同樣因為脫靶的問題，利用TALEN技術進行小鼠的基因修飾仍然無法取代傳統技術。
常見問題與解答
基因敲除小鼠技術專題
一、什麼是ES細胞顯微注射？
答：胚胎幹細胞顯微注射是製作基因敲除小鼠的一個最常用的方法。主要過程是將攜帶目的基因的胚胎幹細胞注射到小鼠的囊胚腔中獲得嵌合體小鼠。所得嵌合體小鼠的組織，將同時含有來源於囊胚的細胞和胚胎幹細胞。嵌合體小鼠必須和野生型小鼠配種以決定遺傳改變的生殖系能否傳遞，這樣可能獲得轉基因或打靶基因（來源於胚胎幹細胞）穩定的生殖系傳遞的小鼠。一般情況下，大約能獲得50%繼承了目的基因的後代。
二、嵌合體
遺傳學上用以指不同遺傳性狀嵌合或混雜表現的個體。免疫學上的涵義則指一個機體身上有兩種或兩種以上染色體組成不同的細胞系同時存在,彼此能夠耐受,不產生排斥反應,相互間處在嵌合狀態。在基因敲除鼠中指通過向囊胚注射被外源基因轉化了的胚胎幹細胞，使得發育成為的個體中含有不同基因型的細胞，產生的個體也叫嵌合體，即該生物體中嵌合了兩種不同遺傳結構的細胞（一種是基因型被改變了的細胞，另一種是原來的基因型的細胞）。
三、條件性敲除的原理？
答：Cre-LoxP系統是源於P1噬菌體的一個DNA重組體系,由Cre酶和相應的LoxP位點組成,它能導致重組發生在特定的DNA序列處(LoxP位點),該系統可以將外源基因定點整合到染色體上或將特定DNA片段刪除。基於Cre-LoxP的基因打靶要分兩步來進行。首先要在胚胎幹細胞的基因組中引入LoxP序列，這一步可以通過打靶載體的設計和對同源重組子的篩選來實現。下一步通過Cre介導的重組來實現靶基因的遺傳修飾或改變。Cre-LoxP系統既可以在細胞水平上用Cre重組酶表達質粒轉染中靶細胞，通過識別LoxP位點將抗性標記基因切除，又可以在個體水平上將重組雜合子小鼠與Cre轉基因小鼠雜交，篩選子代小鼠就可得到刪除外源標記基因的條件性敲除小鼠。
四、如何鑒定和挑選嵌合體？
答：動物只有部分組織細胞整合有外源基因，則稱為嵌合體動物。它的鑒定主要根據毛色去鑒定。注射的ES和囊胚來源不同的小鼠品系。它們的毛色不同。因此可以根據毛色的嵌合率來鑒定和挑選嵌合體。
五、ROSA26與定點插入？
答：利用同源重組技術，把外面的cDNA片段或者其他DNA片段，定點插入到ROSA26位置。ROSA26是一個安全區域，外源性的基因定點插入這個位點不會影響其他基因的表達。
8、基因敲除小鼠 是什麼意思？
「基因敲除小鼠」，就是先在小鼠的胚胎幹細胞上通過基因重組的辦法進行基因修飾——就是將胚胎幹細胞中的靶向基因改掉，然後將「修飾」後的胚胎幹細胞植入小鼠的早期胚胎，生成嵌合體小鼠。這種嵌合體小鼠長大後，體內同時存在被「修飾」過的基因和未被「修飾」的基因。如果某些小鼠的生殖細胞恰巧被「修飾」過了，則它們就會生出基因完全被「修飾」過的小鼠。
這種方法本身就是生物醫學領域里一項極具開創性的方法，同時，由於人類基因與小鼠基因有90％以上的相似性，因此它在理論上具備了用於心臟病、糖尿病等人類遺傳因素引發的疾病研究的可能。