1、骨髓幹細胞的分離
骨髓抽取及骨髓幹細胞的分離純化：患者在無菌條件下從髂後上棘進行穿刺，分不同部位抽取骨髓l0～20 mL，置於肝素化的無菌離心管中，骨髓離心取出脂肪層
2、直接分離人中性粒細胞做實驗效果好不好
小鼠骨髓中性粒細胞的分離
實驗器材：器械（眼科小直剪2把，小彎鑷3把），無菌塑料滴管，15ml離心管，4mlEP管，培養皿，1ml器，70um尼龍篩網，低溫離心機 試劑：PBS（1×，10×），HBSS，percoll，percoll儲存液（percoll:10×PBS=9:1），percoll溶液（45%，81%，62%，55%，50%，分別用1×PBS稀釋Percoll儲存液到相應濃度）Histopaque1119，小鼠中性粒細胞緩沖液（MNB，既含0.1%牛血清白蛋白，1%葡萄糖的HBSS溶液）
材料：8-12周C57小鼠 實驗步驟：
拉頸處死小鼠，分離其脛骨和股骨，用紗布將脛骨和股骨擦乾凈，置於75%酒精中浸泡5min
2.用小直剪剪掉骨髓兩端，暴露骨髓腔，用MNB沖洗，每次1ml，脛骨沖洗兩次，股骨沖洗3次。
3.沖洗液用70um尼龍篩網過濾，離心收集細胞，600g 4℃ 10min,低減速。 4.棄上清，用3ml45%percoll溶液重懸細胞
5.Percoll梯度准備：3ml81%，2ml62%，2ml55%，2ml50%percoll溶液 6.小心的將細胞懸液置於percoll梯度上，1600g,30min,10℃,無制動離心。 7.棄掉62%percoll層以上的溶液，收集62%-81%之間的percoll層。
8.10mlMNB洗兩次，600g,10℃,10min,離心。棄上清，用3mlMNB重懸細胞。
9.將細胞懸液小心得置於3mlHistopaque1119上，1600g,10℃,30min,無制動離心，去除紅細胞層。
10.收集1119和MNB之間的細胞層，10mlMNB 洗兩次，600g, 4℃ 10min,低減速離心 11.按需要將細胞用培養基重懸到一定的濃度。
3、跪謝先，我要收集骨髓液，分離單核細胞提取DNA和RNA。應該怎樣保存骨髓液呢
一般生物樣品都是放在-80冰箱保存，不過如果是蛋白的話，-80冰箱保存兩個月也會降解！RNA時間久更短了。
融化時，打一盒冰 ，樣品放在冰上溶解。
運輸條件一般有兩種，一種是放冰袋到泡沫盒中，另一種就是放乾冰到泡沫盒中，
4、骨髓間充質幹細胞分離的方法有幾種
目前常用的分離MSC的方法主要有全骨髓法和密度梯度離心法，全骨髓法即根據幹細胞在低血清培養基中有貼壁優勢特性，定期換液除去不貼壁細胞，從而達到純化及擴增MSC的目的。密度梯度離心法即根據骨髓中各細胞成分比重的不同，分離單核細胞進行貼壁培養。二者本質上無多大區別。隨著對MSC表面抗原認識的深入，又有人利用免疫方法如流式細胞儀法、免疫磁珠法等對其進行分離純化。但經過流式或磁珠分選後的細胞出現了增殖緩慢等一些問題，加之成本較高和技術的難度，在某種程度上限制了這些方法的廣泛應用。
5、各位大俠，naive T 細胞的分離
GVHD是同種異體造血幹細胞移植(allo-HSCT)後影響預後的 重要並發症。受者預處理造成組織損傷並釋放炎性因子(如IFN-γ、IL-2等)引 起GVHD。最近的研究發現骨髓來源的間充質幹細胞(MSCs)不僅可以分化為 多種間充質組織，而且具有支持造血和免疫調節作用，但其機制尚不清楚。目前 的研究認為供者來源的Naive T細胞識別受者主要組織相容性抗原啟動了 GVHD。我們將體外新生的Naive T細胞接種於異基因MSCs上，觀察MSCs對 Naive T細胞分泌細胞因子的影響，直接研究它對Naive T細胞的作用，將更深入 地揭示其預防GVHD的機制。 材料和方法：
1、 MSCs體外分離培養：將肝素抗凝的骨髓用密度梯度離心 法(過percoll細胞分離液)分離出單個核細胞，體外培養貼壁細胞，傳3代後得 到純度和數量均較高的MSCs，經60Co照射後作為實驗細胞。
2、 臍血CD34+細 胞體外分化為Naive T細胞：將胎兒胸腺組織貼壁培養建立胸腺基質細胞培養 (TSC)體系；用單克隆抗體-磁珠分離系統分離純化臍血CD34+細胞；將CD34+ 細胞植入TSC並添加IL-12、 FL、IL-2，共孵育5周後獲取Naive T細胞並通過 流式細胞術鑒定其表型。
3、 MSCs與Naive T細胞共孵育：將體外培養獲取的 Naive T細胞種入經照射近融合的MSCs中，對照組為單獨MSCs培養和單獨Naive T細胞培養。孵育7天後，取上清用ELISA定量檢測IL-2、 IFN-γ、IL-4和IL-10， 並應用流式細胞儀檢測共孵育前後T淋巴細胞表型變化 結果：1、 人骨髓來源的MSCs可以在體外培養擴增，用流式細胞術分析傳3 代以後的細胞發現它們具有共同的表型CD166+，CD105+， CD45-和CD34-，2、 CD34+細胞可在TSC體系中分化出Naive T細胞，隨著培養時間的延長，與體內 胸腺生成T細胞類似，依次出現CD4／8雙陰性，雙陽性，單陽性細胞。培養第5 周細胞表型測定：CD4+65． 2％，CD8+52． 7％，CD3+78． 8％，CD45RA表達88． 9％。3、 中文摘要 MSCS與NaiveT細胞共孵育七天，鏡下觀察可見共孵育組T細胞數量輕度增加， 流式細胞儀檢測共孵育前後T淋巴細胞表型顯示CDS+細胞相對增加。ELISA檢 測上清發現共孵育組IFN一Y分泌減少(p0 .05)，IL一2分泌增加(p0.05)。另 外，在實驗組和對照組中均未檢測到IL一4、IL一10。 結論:MSCs具有一定的異基因反應性，能刺激NaiveT細胞增生，且MSCs 和NaiveT細胞共孵育組上清中的IL一2分泌增加而IFN一Y分泌減少，提示MSCs 可能借CDS+調節T細胞增生抑制異基因反應性T細胞分泌IFN一Y來發揮免疫調 節作用，本文結果將為進一步闡明MSCs免疫調節機制提供新的線索。
6、骨髓單個核細胞分離，目的用於RNA的提取
用淋巴細胞分離液就可以了。天津生產的，90元一瓶，200毫升。
1 骨髓液3毫升，用3毫升PBS稀釋混勻；
2 平鋪於6毫升淋巴細胞分離液液面上，保持界面清晰；
3 2000轉/分水平離心30分鍾；
4 1毫升針頭吸取中間雲霧層；
5 用PBS洗滌兩次。
骨髓液用抗凝管收集就可以了，不要放到4度冰箱，避免溶血；淋巴細胞分離液使用前室溫平衡；離心機必須為水平離心，不要突然剎車，應使速度緩慢下降；骨髓液和淋巴細胞分離液必須保持界面清晰。
7、外周血細胞分離的方法有哪些？分別如何操作
外周血中除紅細胞外，還有粒細胞、單核細胞和淋巴細胞及血小板等，通常是分離這些血細胞的重要來源。其分離方法有四種：自然沉降法、差異沉降法、氯化銨分 離法、Ficoll分離法。
1、自然沉降法：
將無菌抗凝血放入試管中，在37℃水浴中靜置，自然沉降1-2h，可見到紅細胞下沉，並有明顯分層，上層血漿中富含有大量的 和淋巴細胞，下層主 要為紅細胞。此方法簡便但各層中的細胞種類多，不純。血漿中雖以粒細胞、淋巴細胞為主，但也含有血小板，大單核細胞和少量紅細胞。下層雖以紅細胞為主，但 也有上述各種細胞，此法適用於淋巴細胞轉化試驗。
2、差異沉降法：
用6%的右旋糖酐或3%的明膠溶液無菌消毒後，分裝於中試管中，由於這些物質能使紅細胞形成「串狀」，比粒細胞、淋巴細胞沉降速度快，因而可使紅細胞與白細胞、淋巴細 胞分離開。其方法如下：用6%的右旋糖酐溶液5-10ml，經抗凝血5ml加入上層中混合後靜置於37℃水浴中30-60min，即可見紅細胞下沉，上層富含大量粒細胞和淋巴細胞，下層為紅細胞，使兩者易於分離開， 取上層可用於粒細胞、淋巴細胞培養和實驗，下層可用於紅細胞培養和實驗，經PBS洗3次後即可加入培養基培養，可用於天然白細胞干擾素的誘生和生產。此法 分離的細胞純度也不高。
3、氯化銨分離法：
0.83%氯化銨（NH4CL）可使紅細胞破裂，通常將分離獲得的粒細胞。淋巴細胞中混有的少量的紅細胞用0.83%氯化銨進行裂 解，以排除紅細胞的干擾。另外，此法也適合大量粒細胞、淋巴細胞的分離制備，在天然白細胞干擾素誘生和生產中已被廣泛應用。方法如下：
將中心血站供應的健康人外周血離心分離白細胞黃層懸液先經2000r/min離心20min，吸出上清血漿，將下層的紅細胞、白細胞混合後，加入0.83 氯化銨，用量為血細胞懸液液量的3倍，於4℃作用20min後離心棄去上清。
在沉澱層中再加入新鮮0.83氯化銨混勻後於4℃作用20min，以便徹底清除紅細胞，離心棄上清。
收貨下層的細胞用PBS洗3次後，再用含5%人AB型血清的（含100U/ml卡拉黴素）培養基製成懸液，調整細胞濃度為（8-10）x10^9個/L，分瓶加塞在 37℃普通培養箱中旋轉培養（12r/h）。
混懸細胞時若加入干擾素誘導劑（NDV-F）誘導22h，收貨上清就可生產白細胞干擾素。此法分離的細胞純度更差。
4、Ficoll分離法：
採用Ficoll和泛影葡胺配製而成的淋巴細胞分離液，通過2000r/min離心後可使血細胞以不同相對密度分離開，如分離淋巴細胞可選用相對密度 1.077的分離液；若分離血小板可用相對密度1.090的分離液，若分離骨髓中的單核細胞常用相對密度1.120的分離液，現以淋巴細胞分離為例，方法 如下。
取中心血站供應的抗凝血細胞或初步分離的白細胞黃層細胞懸液，用無鈣、鎂離子的PBS稀釋3-4倍。
將Ficoll淋巴細胞分離液事先分裝於離心管中，使其沉於管底，並在37℃中預熱。
用吸管將經稀釋的血細胞懸液沿離心管壁緩慢加入，不讓細胞懸液沖破分層液界面，使其懸於分層液上方。
以2000r/min離心20min後，不同細胞可依相對密度不同而分布於各位置上，由於紅細胞在Ficoll作用下成串下沉，故在離心管中分布在Ficoll層下方，淋巴細胞分布在Ficoll層上方。
收集渾濁帶分離獲得的淋巴細胞，用無鈣、鎂離子的PBS洗3次後，再用培養基洗1次後計數，分瓶培養。
此法分離獲得淋巴細胞純度高。
分離液的制備：9% Ficoll（20℃下相對密度約1.020）24份與33.4%泛影葡胺（用泛影鈉或Conray400也可，在20℃下相對密度約1.200）10份 混合後，將其相對密度調至1.077金額可獲得淋巴細胞分離液，於121℃高壓蒸汽滅菌30min，室溫保存備用。若配製高相對密度的分離液用加入高濃度 泛影葡胺來調整，若配製低相對密度的分離液用稀釋的Ficoll來調整。
望採納
8、簡述主要免疫細胞分離方法和分離原理？
免疫磁珠法分離細胞原理：
免疫磁珠法分離細胞是基於細胞表面抗原能與連接有磁珠的特異性單抗相結合，在外加磁場中，通過抗體與磁珠相連的細胞被吸附而滯留在磁場中，無該種表面抗原的細胞由於不能與連接著磁珠的特異性單抗結合而沒有磁性，不在磁場中停留，從而使細胞得以分離。
免疫磁珠法分為陽性分離法和陰性分離法：
陽性分離法－磁珠結合的細胞就是所要分離獲得的細胞
陰性分離法－磁珠結合不需要的細胞，游離於磁場的細胞為所需細胞
一般而言，陰性分離法的磁珠用量比陽性分離法的大，陽性分離法用行更多。
BD™ Imag 磁珠：
· 大小在0.1－0.45mm
· 包被了BD Pharmingen生產的高質量單抗
· 磁珠已為白細胞亞群的陽性和陰性分離法所優化
· 用於BD™ IMagnet direct magnet
將包被了特異性單抗的BD IMag磁珠加入細胞懸液，磁珠特異性地與有相應抗原的細胞亞群結合，通過BD™ IMagnet direct magnet分離得到的連有BD IMag磁珠的細胞可直接用於功能試驗和用流式細胞儀檢測。
缺點：
• 對細胞造成機械壓力，影響其生物學活性，不利於分離後培養
• 純度低
• 容易阻塞FCM的噴嘴
BD IMag吸收大磁珠和小磁珠分離系統的優點，開發出直徑約200nm中等大小磁珠。
• 技術簡單，分離在普通的試管中完成
• 易於增大細胞用量
• 對細胞溫和，不影響細胞功能及其分離後培養，可直接上流式
• 純度高，回收率高
• 成本低
此外，Mouse lineage panel中biotin標記的抗體還可用於FCM分析細胞表面抗原，以及進行細胞/組織免疫熒光實驗。
BD提供2種免疫磁珠：
· 包被了針對白細胞亞群的單抗的磁珠
· 包被了鏈霉親和素（streptavidin）的磁珠：此種情況下，在實驗系統中加入生物素標記的單抗，磁珠通過streptavidin與生物素標記的單抗結合，單抗與細胞表面相應抗原特異性結合而使細胞被磁珠間接捕獲，從而達到分離。這種磁珠使研究者可根據自己需要選擇生物素標記的各種單抗去分離目的細胞，應用范圍更廣泛，使用更靈活。
不同物種磁珠分離試劑
人： CD3, CD4, CD8, CD14, CD19；
小鼠： CD4, CD8a, CD14, CD45R/B220, CD90.2 (Thy1.2), CD11b, Ly-6G.
ë 利用Streptavidin連接的磁珠，只需選配biotin標記的所需單抗,就能分離更多種類細胞
新貨聚焦：
現在，BD PMG又推出用於分離小鼠造血幹細胞/祖細胞的新試劑mouse lineage panel。
其中包括5種biotin標記單抗，這些單抗能結合小鼠造血細胞的主要分化系細胞: T、B淋巴細胞，單核/巨噬細胞，粒細胞和紅細胞。將這組試劑與Streptavidin Plus BD™ IMag Particles (557812) 聯合使用，就能通過免疫磁性分離法去除小鼠骨髓造血細胞的主要分化系細胞，從而富集到造血幹細胞和祖細胞（陰性片斷）。
Mouse Lineage Panel（559971）：（5×2ml/vial） 可分離109 Mouse骨髓細胞
1) Biotin-anti-mouse CD3e (CD3 e chain)；
2) Biotin-anti-mouse CD11b；
3) Biotin-anti-mouse CD45R/B220；
4) Biotin-anti-mouse Ly-6G and Ly-6C (Gr-1)；
5) Biotin-anti-mouse TER-119/Erythroid Cells (Ly-76)
磁分離細胞的重要指標是：
純度和得率，這取決於磁珠所連接單抗的特異性和磁珠大小（磁性），然而太大的磁珠會影響細胞活性，也無法直接上流式。
目前市場上有2種磁性細胞分離系統：
* Small particles (≈50 nm) － MACS
* Large particles (1200~4500 nm) －others（如Dynal）
小磁珠 優點：
• 對細胞溫和，不影響分離細胞的後續培養
• 可直接上流式檢測，不影響散射光
缺點：
• 需要很強的磁場來分離細胞
• 分離速度很慢，得率不高
• 需要一次性的分離柱，不能在普通試管進行
• 成本昂貴
大磁珠
• 技術簡單，分離可在試管中完成
• 易於增減細胞用量
• 速度快，得率高
• 成本低
9、如何提取小鼠骨髓細胞?
1、頸椎脫臼法處死小鼠(C57型小鼠)，放在75%酒精中侵泡3-5分鍾後，拎出後將小鼠鋪於超凈台上一個消毒托盤上。
2、無菌提取小鼠的四肢骨，用眼科鑷小心捏起小鼠兩髖關節之間的腹部皮膚，用眼科剪小心剪開皮膚，並分離兩下肢的皮膚，往下在腳踝處剪斷，往上在髖關節處剪斷，這樣可以游離出小鼠的兩條下肢。
3、小心剝離肌肉，分別剪下Femurs（大腿骨）and Tibias（脛骨）,剪去兩端軟骨，露出紅色的骨髓腔。注意盡可能少的剪走骨髓腔。用紗布將骨頭上的肌肉用紗布擦拭乾凈。
4、拿一支1ml的無菌注射器，每支吸取1mlHBSS液，並用無菌的針頭套管將之輕輕擰彎。輕輕插入骨髓腔，沖洗骨髓腔以獲得骨髓，一般用2-3ml培養基沖洗兩次，可沖出絕大部分細胞。
5、過濾：用2OO目的濾網過濾，將濾網的中央插入到離心管裡面25px處，然後用注射器吸取骨髓液，慢慢將骨髓液經濾網注入離心管中，去除殘渣。
6、離心：將離心管放置離心機中離心10分鍾（1350r/min）
7、去上清，加入1ml紅細胞裂解液ACK，靜置3分鍾，再加9ml HBSS溶液，進行離心10分鍾，棄上清。
8、用HBSS液洗滌骨髓細胞2次，室溫，1350r/min離心10分鍾。計數活細胞，用培養基調整細胞濃度至1X106個細胞/ml.
9、在試管中加入RPMI-1640培養基，然後再加入20ng/ml的細胞因子GM-CSF、5%FBS、0.1%的2-巰基乙醇，
10、吸取培養基加入到沉澱中混勻，24孔板鋪板培養，每個孔1ml.
10、分離培養骨髓細胞有何用途
和B細胞融合就是雜交瘤了