骨髓基質細胞的原代培養

1、骨髓間充質幹細胞與骨髓基質幹細胞是同一種細胞嗎

不是一種細胞，具體來源不同，但是都是幹細胞，只是分別由基質細胞、間充質分離培養得到。只知道下面這些，希望有幫助

1、間充質幹細胞(MSCs)是屬於中胚層的一類多能幹細胞，主要存在於結締組織和器官間質中，以骨髓組織中含量最為豐富，由於骨髓是其主要來源，因此統稱為【骨髓間充質幹細胞】。骨髓間充質幹細胞是胎兒和成年人保留在骨髓血液中的原始幹細胞，具有強大的生命力，能被誘導分化為血管組織和骨組織，再生能力強；未分化的間充質細胞（undifferentiated mesenchymal cell）是保留在成體結締組織內的一些較原始的細胞，它們保持著間充質細胞的分化潛能，在炎症與創傷時可增殖分化為成纖維細胞、脂肪細胞。間充質細胞常分布在小血管尤其是毛細血管周圍，並能分化為血管壁的平滑肌和內皮細胞。位於器官之間、組織之間以至細胞之間，起連接、支持、營養、防禦、保護和修復等功能。
一、具有強大的增殖能力和多向分化潛能，在適宜的體內或體外環境下不僅可分化為造血細胞，還具有分化為肌細胞、肝細胞、成骨細胞、軟骨細胞、基質細胞等多種細胞的能力。
二、具有免疫調節功能，通過細胞間的相互作用及產生細胞因子抑制T細胞的增殖及其免疫反應 ，從而發揮免疫重建的功能。
三、具有來源方便，易於分離、培養、擴增和純化，多次傳代擴增後仍具有幹細胞特性，不存在免疫排斥的特性。

2、基質細胞群包括成纖維細胞、網狀細胞及巨噬細胞等，基質細胞在體外培養可形成CFU-F。造血幹細胞被基質細胞包繞後才能增殖。血細胞是在基質細胞形成的網狀支架中增殖和分化。

小知識： 幹細胞的分類與來源

根據其發育階段，於細胞可分為胚胎幹細胞（Embryonic Stem Cell）和成體幹細胞（Alt Stem Cell）。胚胎幹細胞包括ES細胞（Embryonic Stem Cell）、EG 細胞（Embryonic Germ Cell）；成體幹細胞包括神經幹細胞（Neural Stem Ce11， NSC）、血液幹細胞（Hematopoietic Stem Cell，HSC）、骨髓間充質幹細胞（Mesen chymal Stem Cell，MSC），骨髓基質幹細胞，表皮幹細胞（EPidexmis Stem Cell）等。

近年，發現不同胚層起源的成體幹細胞在一定條件下也可相互轉化。如肌肉組織的幹細胞可以「橫向分化」為血液細胞和脂肪細胞。

2、骨髓的原始細胞包括哪些細胞

骨髓的原始細胞包括粒系細胞、紅系細胞、單核系、淋巴系及巨核系，是由造血幹細胞向各系祖細胞分化增殖而來。

粒系及紅系細胞都依次經過原始細胞階段，早幼階段、中幼階段、晚幼階段和成熟階段。淋巴系、巨核系和單核系細胞依次經過原始階段、幼稚階段和成熟階段。

正常骨髓象實際含義是正常范圍骨髓象，下降數據可做為骨髓塗片中各種血細胞正常值的參考： 粒細胞系統佔比例最大，約佔1/2。一般原始粒細胞<0.02，早幼粒細胞<0.05，以中性桿狀核最多，其比值大於分葉核細胞，也多於晚幼粒細胞，嗜酸性粒細胞<0.05，嗜鹼性粒細胞<0.01。

(2)骨髓基質細胞的原代培養擴展資料

骨髓分布於骨髓腔內，哈佛氏管內也含有少量，它主要是由血竇和造血組織構成。血竇是進入紅骨髓的動脈毛細血管分支後形成的竇狀腔隙，形狀不規則，管徑大小不一。竇壁襯著內皮細胞，外面有基膜和周細胞附著。

造血組織位於血竇之間，它的基質是網狀纖維和網狀細胞，它們構成網架，網孔中充滿各種游離細胞，如不同發育階段的各類血細胞和間充質細胞等。

初生時期，骨內充滿的全部是紅骨髓，具有活躍的造血功能。成年後，紅骨髓主要存在於一些扁骨、不規則骨和長骨的骨骺內，以椎骨、胸骨和髂骨處最為豐富，造血功能也最為活躍。

除造血功能之外，紅骨髓還有防禦、免疫和創傷修復等多種功能。其創傷修復功能主要緣於其中的幼稚間充質細胞，它們保留著向成纖維細胞、成骨細胞分化的潛能。

一些學者利用紅骨髓培養的骨髓基質細胞植入骨折及骨缺損處，證實它們可促進骨組織形成，有利於骨折的癒合和缺損的修復。

3、骨髓基質細胞和骨髓間充質幹細胞的區別

骨髓基質細胞是存在於骨髓中的一類多能幹細胞，具有分化成骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞和其他幾種結締組織細胞（如腱細胞）。亦可轉分化成心肌細胞和骨骼肌細胞。骨髓間充質幹細胞現已被歸為結締組織成體幹細胞。事實上，骨髓基質細胞中的間充質幹細胞數量是很少的，約占細胞總數的10萬分之一，其定向分化也不均一，現在越來越多的研究揭示骨髓間充質幹細胞及其初步分化的祖細胞或稱前體細胞(precusor, progenitor cells)具有一些特殊的表面蛋白特徵；此外，幹細胞具有多向分化及自我更新能力，其細胞復制分裂方式是不對稱分裂，這明顯不同於普通的細胞。通過貼壁法或Percoll等細胞分離介質只能獲得混合的骨髓基質細胞，只有應用免疫磁珠、流式細胞儀等將其進一步分離純化後，才能稱為骨髓間質幹細胞。（河南省幹細胞庫）

4、請教小鼠原代脂肪幹細胞的形態及分離培養條件

小鼠脂肪來源幹細胞的分離、培養及鑒定

脂肪來源幹細胞（Adipose-DerivedStemCells,ADSCs)作為組織工程的種子細胞正受到越來越多的關注。 本實驗採用一次消化多次收集與差速貼壁法分離小鼠腹股溝及附睾脂肪組織中的ADSC。通過倒置顯微鏡觀察ADSC的一般形態；透射電子顯微鏡觀察ADSC的超微結構；流式細胞術及激光共聚焦顯微鏡檢測ADSC表面標志；利用特定的誘導液誘導ADSC分化及利用掃描電子顯微鏡觀察ADSC與膠原支架的相容性。 結果顯示ADSC呈長梭形或成纖維細胞樣，旋渦狀或束狀交叉生長。ADSC細胞體積大，胞質內含有線粒體及粗面內質網等細胞器。ADSC的生長符合幹細胞的生長規律，並可在體外穩定傳至第9代。ADSC表達CD44及CD29，不表達CD34。成骨誘導劑誘導後，細胞內鹼性磷酸酶表達量增加，細胞基質發生鈣化。成脂肪誘導劑誘導後，細胞質內可見較多小脂滴。說明ADSC具有分化為成骨細胞及脂肪細胞的潛能。ADSC能夠在膠原支架上鋪展生長，說明其與膠原支架具有良好的相容性。 本實驗建立了分離、培養小鼠ADSC的技術方法，為將來利用小鼠ADSC進行皮膚、肌腱、血管及神經組織修復的動物實驗研究提供了前期實驗基礎和技術支持。

5、大鼠bmscs細胞和人bmscs細胞的區別

研究骨髓基質細胞(BMSCs)移植對大鼠脊髓損傷(SCI)後血管內皮生長因子(VEGF)蛋白表達及神經細胞凋亡的影響,探討骨髓基質細胞移植治療脊髓損傷的機制。[方法]取大鼠股骨和脛骨骨髓培養BM-SCs並傳代。參照Taoka′s方法製作大鼠脊髓壓迫損傷模型。脊髓損傷後30 min,進行BMSCs或DMEM培養液損傷周圍注射。術後3、7和14 d,應用Western Blot法檢測損傷脊髓組織內VEGF蛋白的表達,應用TUNEL方法檢測脊髓損傷周圍神經細胞凋亡情況。[結果]移植術後3、7、14 d,BMSCs組VEGF蛋白的表達水平呈時間依賴性增加,與DMEM組相比,術後3 d兩組VEGF蛋白表達水平沒有顯著性差異(P>0.05),而術後7和14 d,BMSCs組VEGF蛋白表達水平顯著高於DMEM組(P<0.01)。此外,與DMEM組大鼠相比,移植術後3、7和14 d,BMSCs移植顯著減少脊髓損傷周圍區凋亡的神經細胞數目(P<0.05)。[結論]脊髓損傷後,BMSCs移植能夠增加VEGF蛋白的表達並且抑制神經細胞凋亡。

6、骨髓基質細胞原代培養好做嗎

原代細胞(primarycell)是指從機體的組織(如人組織、小鼠組織、大鼠組織和兔組織等)經蛋白酶或其它的方法獲得單個細胞並在體外進行模擬機體培養的細胞，稱為原代細胞。一般認為，培養的原代的第1代細胞和傳代到第10代以內的細胞統稱為原代細胞培養。在人工條件下使其原代細胞生存、生長、繁殖和傳代，進行細胞生命過程、細胞癌變、細胞工程等問題的研究。細胞株(cellstrain)是通過選擇法或克隆形成法從原代培養細胞中獲得具有特殊性質或標志物的細胞稱為細胞株。一般認為，細胞株是用單細胞分離培養或通過篩選的方法，由單細胞增殖形成的細胞群。細胞株的特殊性質或標志必須在整個培養期間始終存在。細胞系(cellline)是原代細胞經首次傳代成功後即為細胞系。泛指一般可能傳代的細胞。其中能夠連續傳代的細胞叫做連續細胞系或無限細胞系，不能連續培養的稱為有限細胞系。大多數二倍體細胞為有限細胞系。由原先存在於原代培養物中的細胞世系所組成。如果不能繼續傳代，或傳代次數有限，可稱為有限細胞系(finitecellline)，如可以連續培養，則稱為連續細胞系(continuouscellline)，培養50代以上並無限培養下去。人類腫瘤細胞，在體外培養半年以上，生長穩定，並連續傳代的即可稱為連續性株或系。

7、哪位做過脂肪細胞原代培養

方案 23.12 脂肪細胞的原代培養

實驗材料

DMEM-ADMEM-B膠原蛋白酶雄性 Sprague-Dawley 大鼠

試劑、試劑盒

KRBH緩沖液KRBH-A緩沖液

儀器、耗材

Petri培養皿錐形離心管聚丙烯管低密度聚丙烯瓶尼龍濾網尖解剖剪Perry鑷塑料箱鍘刀移液器

實驗步驟

一、切除附睾脂肪墊

1. 在充有 70 % CO2 和 30 % O2 混合氣體的塑料箱內麻醉大鼠（雄性 Sprague-Dawley 大鼠：145~170 g，CD 系（Charles River Breeding Laboratories）。

2. 用鍘刀斷頭放血。

3. 將鼠體在 70 % 乙醇內浸泡一會兒。

4. 盡量在無菌條件下切除附睾脂肪墊。

(a)用一把解剖剪剖開下腹部皮膚，暴露腹膜。

(b)用另一把解剖剪剖開腹膜，然後用 Perry 鑷向上牽拉睾丸。

(c)剪取附睾脂肪墊，注意保留血管。

5. 將組織移送到培養實驗室。

脂肪細胞的膠原蛋白酶（在 2 ml KRBH 緩沖液加入 20 mg/ml 膠原蛋白酶，然後用 0.22 μm 濾器過濾）消化和洗滌

6. 將 4 g 脂肪墊（相當於 8 個附睾的脂肪墊）放入盛有 4 ml KRBH 緩沖液 （Krebs-Ringer 液，pH 7.4，添加 10 mmol/L NaHCO3、30 mmol/L HEPES（Sigma）、200 nmol/L 腺苷（Boche）和 1 % BSA （W / V，Intergen）。配製 1 L KRBH 緩沖液時，用 7 g NaCl、0.55 g KH2PO4、0.25 g MgSO4 7H2O、0.84 g NaHCO3、0.11 g CaCl2、7.15 g HEPES、10 g BSA、1 ml 200 μmol/L 腺苷， 加超凈水至 1 L。然後，按 100 ml 分裝。使用前加熱至 37°C，並將 pH 調整至 7.4。）（37°C）的 30 ml 低密度聚丙烯瓶內。

7. 將脂肪墊剪成直徑約為 2 mm 的組織塊。

8. 將組織塊放入瓶內，然後加入 1 ml 膠原蛋白酶液。在 37°C 水浴振盪器孵育約 1 h，直至細胞混合物形成乳脂樣濃稠液體。

9. 膠原蛋白酶消化後，向瓶內加入 4 ml KRBH 緩沖液（37°C）。

10. 通過攪拌混勻瓶內的細胞，然後用孔徑為 250 μm 的尼龍濾網（孔徑為 250 μm，放入支持物或漏斗內）將細胞輕輕濾入 50 ml 錐形離心管。

11. 通過向離心管內加入 30 ml KRBH 緩沖液（37°C）洗細胞。用台式離心機短時間離心（ 200 g），然後用吸管吸出下清液。注意脂肪細胞浮在水性緩沖液的上面。

12. 通過加入 40 ml KRBH 緩沖液洗細胞，離心，除去下清液。重復該步驟 1 次。

13. 用 40 ml DMEM-A （DMEM，pH 7.4，添加 25 mmol/L 葡萄糖、2 mmol/L 谷氨醯胺、200 nmol/L（R )-N6-（l-methyl-2-phenylethyl）腺苷（PIA，Sigma）、100 μg/ml 慶大黴素和 25 mmol/L HEPES。按 100 ml 分裝，使用前加熱至 37°C）（37°C）洗細胞 2 次。

14. 用約 40 % cytocrit DMEM-A 混懸漂浮的細胞。

二、脂肪細胞的原代培養

15. 用 200 μl 大口徑吸頭將 2 ml 40 % cytocrit DMEM-A 懸液移入 60 mm 培養皿。

16. 將培養皿放入濕潤的培養箱，在 37°C 和 5 % CO2 的條件下培養 1.5 h 。

17. 向培養皿內加入 5 ml DMEM-B（DMEM-A，添加 7% BSA）。

此時，應進行葡萄糖攝取實驗 [ Quom 1998 ]，檢査細胞的活力。

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中山醫科大學學報(AcadJSUMS),2001,22(6):443~446443

人前脂肪細胞的原代培養

王竹晨1,劉建中2,李??燕2,楊冬梓1,鄺健全1

(中山醫科大學??1.孫逸仙紀念醫院婦產科,2.生物教研室,廣東廣州??510120)

摘??要:??目的 建立人前脂肪細胞原代培養方法,以更深入地研究人體脂肪組織增生的生物學特徵。??方法 選用成人的腹部脂肪組織,採用原代消化細胞培養法培養出棱形細胞;同時取皮膚組織,進行成纖維細胞培養作為對照。??結果 培養出的棱形細胞成分均一,增殖旺盛,分化率高。經形態學動態變化的觀察,生長曲線及油紅O脂肪染色抽取法測定,證明是功能活躍的前脂肪細胞,並在體外重現了其增殖的全過程。??結論 在成熟的脂肪組織中存在著可分化成熟、生成脂肪的前脂肪細胞。由於脂肪細胞是胰島素作用的經典靶細胞之一,本實驗為進一步研究與肥胖及胰島素抵抗相關的疾病如多囊卵巢綜合症等打下了基礎。

關鍵詞:前脂肪細胞;細胞培養;脂肪組織

中圖分類號:Q254,R711.75??????文獻標識碼:A??????文章編號:1000-257X(2001)06-0443-04

WANGZhu??chen1,LIUJian??zhong2,LIYan2,YANGDong??zi1,KUANGJian??quan1

(1.,SunYat??senMemorialHospital,2.DepartmentofBiology,

SunYat??,Guangzhou510120,China)

Abstract:??Objective .??Methods Usingprimarycellculture,fibroblast??..??Results Thecellswerehighlyhomogeneous,.,growthcurve,,.Undercontrolledconditions,.??Conclusion Inmaturehumanadiposetissue,.,thisstudylaidthebasisforfur??syndrome.

Keywords:preadipocyte;cellculture;adiposetissue

????脂肪細胞是胰島素作用的經典靶細胞之一,與

肥胖及胰島素抵抗相關疾患如多囊卵巢綜合症的

研究關系密切,近年來受到婦科內分泌領域的重

視。前脂肪細胞是一類具有增殖和向脂肪細胞分

化能力的特異化的前體細胞,它的存在和作用持續

於人的一生,我們從人脂肪組織中培養出了前脂肪

細胞,為進一步研究打下了基礎。

????收稿日期:2001-04-23

????基金項目:廣東省衛生廳科研基金資助課題(2001189)

????,;1??材料與方法1.1??組織來源選取2000年9月~2001年1月本院婦科內分泌病房行輸卵管復通術的正常體重患者。年齡20~40歲,身體健康,無其他急慢性疾病。術中開腹時切取皮下脂肪組織及皮膚組織。

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1.2??試驗材料

1.2.1??主要試驗用品和化學試劑??DMEM/F??12培養基(1!1),無支原體胎牛血清,?型膠原酶,Hepes,人轉鐵蛋白,青、鏈黴素原液均購自GIBCO公司;生物素、泛酸鹽、氫化可的松,三碘甲狀腺原胺酸(T3),3??異丁基??1??甲基黃嘌呤均系SIGMA公司產品。牛血清白蛋白購自Roche公司。試驗所需無機試劑購自廣州市醫葯公司化試批發部,均系分析純試劑。培養瓶購自KORNING公司。

1.2.2??培養基及主要試劑的配製??培養基A[1]中山醫科大學學報(AcadJSUMS),2001,22(6)培養基A製成細胞懸液,接種至25cm2培養瓶內,密度為每平方厘米3?10個細胞,置37#,體積分數5%CO2培養箱內孵育16h後,PBS輕輕洗去培養瓶內未粘附的物質,換用培養基C誘導和維持脂肪細胞分化,3d後更換為培養基B,以後每2~3d更換一次培養基B。1.3.2??人前脂肪細胞及皮膚成纖維細胞的組織學染色??蓋玻片剪成0??5cm?1??0cm大小,接種時置入培養瓶內,待細胞貼壁後每2、3d從培養瓶內取出染色。將貼有脂肪細胞的面朝上,浸入體積分

數為10%甲醛的等滲鹽緩沖液中固定10min,然後放入PBS緩沖液中,輕輕漂洗片刻,直立使殘留水份流到邊緣,吸水紙吸掉。稍乾燥後,人前脂肪細胞採用蘇丹%??&滴染法及Mayer蘇木素復染細胞核,甘油明膠封片;皮膚成纖維細胞採用常規蘇木素-伊紅染色,脫水透明後中性樹脂封片,光鏡觀察並拍照保留結果。

1.3.3??細胞生長曲線的繪制??將細胞懸液等量接種至24個培養瓶內,隨機分成8組,每組3瓶,每2d檢測一組中每個瓶中的細胞總數,取3個瓶的均值,如此至第8組結束。細胞計數方法參照醫學細胞生物學實驗[3]。

1.3.4??油紅O染色提取法測定細胞內的脂肪含量??接種方法同1.3.3,根據Ramirez[2]4:按說明取DMEM/F??12培養粉5g,加入胎牛血清使其體積分數為10%,三蒸水定容至500mL;培養基B:按說明取DMEM/F??12培養粉10g,加入終濃度分別為15mmol/LNaHCO3,15mmol/LHep??es,33??mol/L泛酸鹽,17??mol/L人轉鐵蛋白,100000U/L青黴素,0??1g/L鏈黴素,100nmol/L氫化可的松,60nmol/L胰島素,0??2nmol/LT3,三蒸水定容至1000mL;培養基C:取培養基A200mL,加入3??異丁基??1??甲基黃嘌呤,使其終濃度為0??25mmol/L;消化液:稱取膠原酶(?型)150mg,牛血清白蛋白2g,0??01mol/L磷酸緩沖鹽溶液(PBS)定容至100mL;紅細胞溶解緩沖液:稱取適量NH4Cl,K2HPO4和EDTA,使其終濃度分別為154mmol/L,5??7mmol/L,和0??1mmol/L,三蒸水

定容至250mL。上述溶液均經調整pH值至7??4~7??6,0??22??m微孔濾膜正壓過濾除菌,分裝後置-30#保存。油紅O工作液[2]等的方法測定。培養物用體積分數10%甲醛的等滲鹽緩沖液固定1h後,蒸餾水漂洗。吸取油紅O工作液10mL,使培養面向下浸染,2h後倒掉瓶內的油紅O

工作液,蒸餾水漂洗培養瓶數次,直至完全漂浮干凈。將已染色的培養瓶置於32#孵箱內蒸發掉瓶內的水份後即加入1mL異丙醇,萃取出的染液即刻用吸管移出,於HITACHIG2000型分光光度計510nm波長處測吸光度。:稱取4??2g油紅O溶於1200mL異丙醇中室溫靜置過夜,分析濾紙過濾後收集濾液,並加入900mL三蒸水,於4#再次靜置過夜後過濾兩次即可於室溫貯存備用。1.2.3??儀??器??CO2培養箱,倒置顯微鏡等。1.3??方??法

1.3.1??人前脂肪細胞及皮膚成纖維細胞的原代培養[1]??術中切取脂肪組織約60g,同時切取皮膚組織約0??5cm?3cm進行成纖維細胞培養作為對照。PBS洗滌,分離去除脂肪組織中肉眼可見的纖維成份及血管,皮膚組織則需去除表皮和皮下脂肪,剪碎成約2mm?2mm的小塊,加入消化液,置37#,體積分數5%CO2培養箱內消化。15h後,200?g短時離心,去除漂浮的脂肪細胞及培養液,沉積的細胞用紅細胞溶解緩沖液再次配成細胞懸液,37#孵育10min,以去除污染的紅細胞,150??2??結??果2.1??原代培養的人前脂肪細胞及皮膚成纖維細胞形態學觀察細胞貼壁後初為小圓形,核/漿比例較大(圖1??1),4d即可觀察到細胞漸成梭型,7d左右此棱形細胞大量繁殖,面積達到培養瓶底1/2之後開始積聚脂肪顆粒(圖1??2)。9d可觀察到細胞由棱形漸變成橢圓形或圓形(圖1??3),積聚有脂肪顆粒的

第6期??王竹晨,等.人前脂肪細胞的原代培養445肪細胞(圖1??4)。體外培養的脂肪細胞體積較大,細胞膜較薄,膜輪廓不光滑,凹凸不平有皺折,胞質內有大量圓形脂滴,大小不等且多散在,也有小脂滴大量觸合成大脂滴的情況,核仍位於邊緣,而同時培養的皮膚成纖維細胞增殖速率相似,但始終為長棱形,無脂滴積聚(圖2??1,圖2??2)。

2.2??人前脂肪細胞及皮膚成纖維細胞的生長曲線

由生長曲線可見人前脂肪細胞(圖3??1)和皮膚成纖維細胞(圖3??2)的倍增時間分別為60h和55h

。3??討??論3.1??人前脂肪細胞培養在婦科內分泌領域的研究意義脂肪細胞是脂肪組織的重要組成部份,也是其發揮功能的主體。當代研究認為脂肪組織中脂肪細胞非常活躍,細胞的數目,形態及細胞內脂肪的含量均處於動態變化之中,並保持終生。肥胖症被認為是脂肪細胞增殖和分化失控的結果。目前,肥

胖已成為與婦科內分泌領域密切相關的疾病,肥胖可產生胰島素抵抗/高胰島素血症,而胰島素抵抗/高胰島素血症是許多臨床疾病或病症,尤其是常見的內分泌代謝性疾病如糖尿病、高血壓和動脈粥樣硬化等的共同危險信號,因此成為近年醫學多學科共同感興趣的研究熱點。特別是近年的研究發現

圖3.1??人前脂肪細胞生長曲線

Fig.3.1??

culture胰島素抵抗/高胰島素血症還與育齡婦女高雄激素血症及無排卵有關。臨床常見的多囊卵巢綜合症,

生育年齡婦女中約有5%~10%患者此症,常伴有肥胖,病因不明。目前認為多囊卵巢綜合症即是以胰島素抵抗為特徵的內分泌代謝性疾患,繼發於胰島素抵抗的高胰島素血症對造成高雄激素徵象起著重要作用,並致不孕[4]。脂肪細胞作為對胰島素

圖3.2??人皮膚成纖維細胞生長曲線

Fig.3.2??敏感的靶細胞之一,因此對其潛在胰島素抵抗機制的研究具有特殊臨床意義。體外前脂肪細胞培養

能完整地認識脂肪組織的發生和增生的全過程,並且可以直接觀察各種因素對這個過程的調控,研究其機制,是研究脂肪組織的理想模型。國外雖已建立了來源於鼠的前脂肪細胞的細胞株如3T3??L1、3T3??F442A,ob17系列等,但到目前為止,尚未見有人的前脂肪細胞株建立[5],因而使進一步的研究受到了限制。

3.2??體外培養的人前脂肪細胞的生物學特性

目前國內外前脂肪細胞體外培養系統大致有兩類,一類來源於血管基質組份細胞(stromalvas??cularfraction,SVF),這是經典的前脂肪細胞。Van等[6]對SVF的系統研究形成了完整的前脂肪細胞理論。他們將切下的脂肪組織用膠原酶處理,再將組織懸液離心,其中的沉澱物基質血管成份即是SVF,將其SVF進行培養,和培養的成纖維細胞比較,這兩種培養物以差不多的速率增殖,倍增時間約55h左右。在顯微鏡下比較細胞,發現起初2.3??前脂肪細胞及皮膚成纖維細胞生長過程中細胞內脂肪含量的變化前脂肪細胞內的脂肪含量於培養9d後迅速增加,16d左右到達高峰,而皮膚成纖維細胞內僅有極少的脂肪積聚(圖4)

。圖4??前脂肪細胞及皮膚成纖維細胞生長過程中細胞內脂肪含量的變化Fig.4??lture

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可積聚大量脂滴,而成纖維細胞的胞漿內則無或只有少量的脂滴。這就證明了SVF是具有增殖和向脂肪細胞分化潛能的前脂肪細胞。本實驗研究結果與之相符,符合文獻中提出的3個標准[6]。此外,近年還有人報道採用脂肪組織塊貼壁和天花板培養相結合的方法也獲得了成功[7]。此種方法得到的前脂肪細胞與SVF不同,可能來源於Carraro等發現的成熟脂肪細胞內都有的一種細胞島[8]。但此種方法是採用有血清培養並且與成熟脂肪細胞共同孵育,不適於作為成熟脂肪細胞所分泌的某些細胞因子的體外研究模型。

前脂肪細胞的培養闡明了其增殖和分化的關系,目前認為這是一種生長停頓?生長再續?細胞分化的連續關系。生長停頓是必要的第一步,此後這些細胞至少進行一次以上的再分裂,才繼續向成熟脂肪細胞轉化。並隨時間的推移出現甘油??3??磷酸脫氫酶(GPDH)mRNA這個晚期標志物,這也是脂肪合成所必需的限速酶,並最終變成脂肪細胞。我們的研究也觀察到細胞貼壁後經過一段時間的潛伏期後開始生長,3、5d左右大量增殖,1周後開始有脂肪顆粒的積聚。培養2周時,分化成多脂滴或單脂滴的脂肪細胞,與文獻報道一致。

油紅O染色提取法可簡便、快速地對體外培養的前脂肪細胞轉化率進行定量。文獻報道其准確性和敏感性與測定前脂肪細胞分化過程中的標志酶GPDH相似[2]。因此常用來作為對體外培養的前脂肪細胞進行鑒定。體外培養的前脂肪細胞在胰島素、氫化可的松等的作用下,GPDH即開始上升並迅速增加,8d左右達到高峰並維持在高水平[2]。我們採用油紅O染色提取法進行研究,結果表明,前脂肪細胞在培養第3天即開始有脂肪的積聚,1周後積聚量明顯增多,2周時達到高峰,與形態學上的培養1周後細胞內開始出現脂肪顆粒相吻合。並說明酶的出現在先,脂肪出現在後,細胞內脂肪含量的明顯增加比GPDH的出現要晚1周左右,與文獻報道相吻合[2]。

3.3??人前脂肪細胞培養技術的特點

脂肪組織來源於原始的網狀結締組織,由結締組織和脂肪細胞組成,細胞成分中以脂肪細胞為主,此外還含有網狀細胞,間充質細胞,組織細胞,內皮細胞等。脂肪細胞和成纖維細胞均來自中胚層,因此培養脂肪細胞和培養成纖維細胞具有相似[9]中山醫科大學學報(AcadJSUMS),2001,22(6)外培養條件有差異[10],不同的是需要促脂肪形成因子的作用,目前已知的這類物質有:胰島素、糖皮質激素、甲狀腺素、生長激素、轉鐵蛋白,3??異丁基??1??甲基黃嘌呤,纖維粘連素等。培養基一般採用DMEM和F12按1!1比例配製,細胞數量適中,初次接種時細胞貼壁不十分牢固,動作要輕柔以免細胞漂浮。選用的取材對象越年輕越容易生長。人類一般選用外科手術切取腹部脂肪組織,如用注射器抽吸則易損傷細胞,降低成活率。(本文圖1,2見插頁2)參考文獻:[1]HaunerH,PetruschkeTH,RussM,etal.(TNF??)??[J].Dibetologia,1995,38(7):764.[2]Ramirez??ZacariasJL,Castro??MunozledoF,kuri??Har??cuchW.??[J].Histochemistry,1992,97(6):493.[3]趙??剛,劉建中.醫學細胞生物學實驗與習題[M].北京:科學出版社,1999.35.[4]DunaifA.??drome[J].Endocrinol&MetabClinNorAm,1999,28(2):341.[5]BillingsE,MayJW.Historicalreviewandpresentsta????constructivesurgery[J].PlastReconstrSurg,1989,83(2):368.[6]VanRLR,BaylissCE,RoncariDAK.rsinculture[J].JClinInvest,1976,58(9):699.[7]朱曉海,何清濂,林子豪.人前脂肪細胞培養及增殖與分化模型的建立[J].中華整型燒傷外科雜志,1999,15(3):199.[8]CarraroR,LiZH,JohnsonJE.ntratadipocytes[J].CellTissRes,1991,264(2):243.[9]劉??清,鄧漪平.內皮-平滑肌聯合培養:細胞間相互作用對組織型纖溶酶原激活劑的影響[J].中山醫科大學學報,1992,13(4):18.[10]朱永源,利天增,蘇愛雲,等.人表皮細胞的體外培養[J].中山醫科大學學報,1998,19增刊:34.(??,)

8、膠原酶和胰酶在細胞原代培養中的區別

酶的濃度 胰蛋白酶一般採用的濃度為 0.1%-0.25%（活力 1:200 或 1:250），但遇到難消化的組織時，濃度可適當提高，消化時間適當延長。濃度高對細胞有毒性，而較低濃度的胰蛋白酶在培養液中可促進細胞的增殖，若培養液中加入血清，其少量胰蛋白酶可被血清中抗胰蛋白酶因子所清除。

溫度 一般認為胰蛋白酶在 56℃時活性最強，但由於對細胞有損害而不能被採用，常使用的溫度為 37℃，通常在 37℃進行消化比室溫作用快。

pH pH8~pH9 是胰蛋白酶活力適宜范圍，但隨鹼性的增加其活力也隨之減少，活性強分散快，細胞也容易被消化下來，消化分離細胞時 PH 只能選用 7.6~8.0 之間，否則對細胞有損傷。

無機鹽離子 若用含有鈣和鎂的鹽類溶液來配製胰蛋白酶時，可以發生抑制胰蛋白的消化作用。因此，在配製時應採用無鈣鎂離子的 PBS 配製。

　  消化時間 如果細胞消化時間過長，可以損害細胞的呼吸酶，從而影響細胞的代謝，一般消化時間為 20 分鍾為宜，冷消化時使用低濃度消化液，於 4℃過夜也可。

分離方法如下：

①過夜冷消化 將取得的組織用 Hanks 液洗三次，剪成碎塊大小為 4 毫米左右，用 Hanks 液洗 2~3 次以除去血球和脂肪組織，再加入 0.25% 的胰蛋白酶，搖勻後放 4℃過夜，次日再用 Hanks 液洗滌，棄去上清，共洗 2~3 次，然後，加入少量營養液吹打分散，細胞計數，按適當的濃度分瓶培養。

②多次提取消化法 多次提取消化法有以下三種：

熱消化多次提取 -- 將剪碎的細胞塊加入 0.25% 胰蛋白酶 37℃水浴中消化 15~20 分鍾，然後經洗滌後用營養液分散製成細胞懸液，按合適的濃度分瓶培養，然後將留下的未徹底消化的組織按上述方法操作，再消化提取細胞。

冷消化多次提取 -- 方法同上，只是消化溫度為 4℃。

先熱消化後冷消化 -- 將組織塊先用胰蛋白酶於 37℃下消化 20 分鍾經洗滌後用營養液分散，製成懸液，剩餘未消化的小組織塊經洗滌後用胰酶於 4℃下過夜，次日再提取細胞，分散成懸液，分瓶培養。

 膠原酶（Collagenase）消化法

膠原酶是一種從細菌中提取出來的酶，對膠原有很強的消化作用。適於消化纖維性組織、上皮組織以及癌組織，它對細胞間質有較好的消化作用，對細胞本身影響不大，可使細胞與膠原成分脫離而不受傷害。該酶分離效果好，即使有鈣、鎂離子存在仍有活性，故可用 PBS 和含血清的培養液配製，即操作簡便又可提高細胞成活率，最終濃度 200u/mL 或 0.1~0.3mg/mL. 此酶消化作用緩和，無需機械振盪，但膠原酶價格較高，大量使用將增加實驗成本。

經過膠原酶消化後的上皮組織，由於上皮細胞對酶有耐受性，可能有一些上皮細胞團塊尚未被完全消化開。成小團塊的上皮細胞比分散的單個上皮細胞更易生長，因此不必要再進一步消化處理。

非酶消化法（EDTA 消化法）

EDTA 是一種非酶消化物，又稱螯合劑或 Versene, 全名為乙烯二胺四乙酸。常用不含鈣、鎂離子的 PBS 配成 0.02% 的工作液，對一些組織，尤其是上皮組織分散效果好，該化學物質能與細胞上的鈣、鎂離子結合形成螯合物，利用結合後的機械力使細胞變圓而分散細胞或使貼壁細胞從瓶壁上脫離，缺點是細胞易裂解或貼壁細胞從瓶壁上脫離時呈片狀，有團塊，常不單獨使用，但可與胰蛋白酶混合使用（1:1 或 2:1），不僅利於細胞脫壁又利於細胞分散，可降低胰酶的用量和毒性作用。

消化分離法的操作步驟：

（1）剪切 把組織塊剪碎，呈 1~5mm3 大小的組織塊。

（2） 加液漂洗 將碎組織塊在平皿（或三角燒瓶）中用無鈣鎂 PBS 洗 2-3 次（採用傾斜，自然沉降法）。

（3）消化 加入消化液（胰蛋白酶或膠原酶或 EDTA）於 37℃水浴中作用適當時間（中間可輕搖 1~2 次），若組織塊膨鬆呈絮狀可終止，若變化不大可更換一次消化液，繼續消化直至膨鬆絮狀為止。胰蛋白酶消化時間不宜過長。

（4）棄去消化液 採用傾斜自然沉降或低速離心法盡量棄去消化液。

（5）漂洗 將含有鈣、鎂離子的培養基沿瓶壁緩緩加入，中止消化反應，採用漂洗法洗 2-3 次後，加入完全培養基。

（6）機械分散 採用吸管吹打或振盪法，使細胞充分散開後用紗網或 3~4 層無菌紗布過濾後分瓶培養，若要求不高可採用傾斜自然沉降 5~10 分鍾，吸上層細胞懸液進行分瓶培養。

注意事項如下：

（1）組織塊必須漂洗 2-3 次以除去組織中的鈣、鎂離子和血清對胰蛋白酶和 EDTA 的抑製作用。

（2）胰蛋白濃度不宜過高，作用時間不能太長，以避免毒性作用。

（3）消化後組織不僅要盡量棄去消化液，以避免毒性產生，而且動作要輕，以避免膨鬆的細胞隨漂洗而丟失。

　  原代細胞的培養方法

原代細胞的培養也叫初代培養 是從供體取得組織細胞在體外進行的首次培養，是建立細胞系的第一步，是一項基本技術。原代細胞因剛從組織中分離開，生物學特性未發生很大變化，仍保留原來的遺傳特性，也最接近和反映體內生長特性，適宜用於葯物敏感性試驗、細胞分化等實驗研究。

原代細胞往往有多種細胞組成，比較混雜，即使從形態上為同一類型（上皮樣或成纖維樣），但細胞間仍有很大差異。如果供體不同，即使組織類型、部位相同，個體差異也照樣存在，原代細胞生物特性尚不穩定，如需做較為嚴格的對比性實驗研究，還需進行短期傳代培養。

1、組織塊培養法

組織塊培養是常用、簡便易行和成功率較高的原代培養方法，也是早期採用培養細胞的方法，故原先被稱為組織培養。其方法：為將剪成的小組織團塊接種於培養瓶（或皿）中，瓶壁可預先塗以膠原薄層，以利於組織塊粘著於瓶壁，使周邊細胞能沿瓶壁向外生長，方法簡便，利於培養，部分種類的組織細胞在小塊貼壁 24 小時後細胞就從組織塊四周遊出，然後逐漸延伸，長成肉眼可以觀察到的生長暈，5~7 天後組織塊中央的組織細胞逐漸壞死脫落和發生漂浮，此漂浮小塊可隨換液而棄去，由組織塊周圍延伸的貼壁細胞也逐漸形成層片，可在顯微鏡下觀察形態和用於實驗研究。

其培養方法如下：

（1）按照前述方法取材，將組織剪成或切成 1mm3 大小的小塊，並加入少許培養基使組織濕潤。

（2）將小塊均勻塗布於瓶壁，每小塊間距 0.2 cm~0.5cm，一般在 25mL 培養瓶（底面積為 17.5cm2）可接種 20~30 小塊為宜，小塊放置後，輕輕翻轉培養瓶，使瓶底朝上，然後於瓶內加入適量培養基蓋好瓶塞，將瓶傾斜放置在 37℃溫箱內。

（3）培養 2~4 小時，待小塊貼附後，將培養瓶緩慢翻轉平放，靜置培養，動作要輕，嚴禁搖動和來回振盪，以防由於沖動而使小塊漂起而造成培養失敗，若組織塊不易貼壁可預先在瓶壁塗一薄層血清、胎汁或鼠尾膠原等。開始培養時培養基不宜多，以保持組織塊濕潤即可，培養 24 小時後再補液，培養初期移動和觀察時要輕拿輕放，開始幾天盡量不去搬動，以利貼壁和生長，培養 3~5 天時可換液，一方面補充營養，一方面去除代謝產物和漂浮小塊所產生的毒性作用。

原代細胞培養 -2

2、消化培養法

該方法是採用前述的消化分散法，將妨礙細胞生長的細胞間質（包括基質、纖維等）去除，使細胞分散形成細胞懸液，然後分瓶培養。

某些特殊類型細胞，如內皮細胞、骨細胞等的消化手段和步驟，將在有關章節中敘述。

3、懸浮細胞培養法

對於懸浮生長的細胞，如白血病細胞、淋巴細胞、骨髓細胞、胸水和腹水中的癌細胞和免疫細胞無需消化，可採用低速離心分離，直接培養，或經淋巴細胞分層液分離後接種培養。

4、器官培養

器官培養是指從供體取得器官或組織塊後，不進行組織分離而直接在體外的特定環境條件下培養，其特性仍保持原有器官細胞的組織結構和聯系、並能存活，器官培養的目的和技術均與單層細胞培養不同，但可利用器官培養對器官組織的生長變化進行體外觀察。並觀察不同培養條件研究對器官組織的影響。器官培養可保持器官組織的相對完整性，可用於重點觀察細胞間的聯系、排列情況和相互影響，以及局部環境的生物調節作用。體外器官培養為臨床上的器官移植創造了便利的條件。器官培養的條件與細胞培養不同，要有特殊的要求。

1、器官培養的特殊的要求

（1）需要特殊的培養條件 因器官離體培養，其營養和氧氣僅靠自然滲透來供給，因此，培養時為了確保中心不發生缺乏氧和營養而造成壞死，其厚度或直徑不宜超過 1mm.

（2）器官內部細胞需要有足夠的氧氣滲入 常採用以下兩種方法：

a. 將器官組織塊置於培養基氣液面以利於氣體交換。

b. 提高培養基中的氧分壓，一般需加註純氧，提高氧分壓時仍需保持 5% CO2, 以維持 pH.

2、器官培養的方法

（1）將不銹鋼網做成的支架，放置於培養皿中，高度為 1/2 皿高，使其表面鋪上 0.5mm 孔徑的濾膜。

（2）將培養基加入平皿中，使培養液剛剛接觸到濾膜，但不要使濾膜浮起。

（3）將要培養的器官組織平放在濾膜上，一般厚度不要超過 200μm, 水平面積不超過 10mm2, 如為肝、腎不能大於 1mm2.

（4）將培養物置於 CO2 培養箱內，並加註氧氣，調整氧分壓達 90%, 培養時注意使液面與膜保持在一致的水平上。

（5）上述器官培養 1~3 周（每隔 2~3 天換液一次）後可用於實驗和檢測。